[发明专利]一种利用DNA甲基化的方法检测苯丙酮尿症的试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于氨基酸代谢紊乱疾病诊断技术领域，具体涉及一种利用DNA甲基化的方法检测苯丙酮尿症的试剂盒。

背景技术

苯丙酮尿症(PKU)是一种常染色体隐性遗传病，涉及位于第12号染色体长臂上的苯丙氨酸羟化酶基因缺陷，导致肝脏内苯丙氨酸羟化酶活性丧失，引起苯丙氨酸代谢障碍。苯丙酮尿症在我国发病率约为1/11800。苯丙酮尿症在遗传上属于单基因遗传病，呈世界性分布，在人群中的发生率随地区、种族而异，如日本1∶70000、美国1∶12000～1∶18000，通过氨基酸分析发现苯丙酮尿症患者血液苯丙氨酸含量高出正常人15倍。氨基酸是构成生命大厦的砖石，人体各种体液中氨基酸组成的变化能够直接反映机体的健康水平和营养状况，并与多种病理过程有关。

本发明的发明人临床氨基酸分析25例PKU患者血清及85例正常人血清，发现PKU患者血清精氨酸含量为(0.014±0.008)，正常人血清精氨酸含量为(0.129±0.014)数据显示两者差异明显(p＜0.001)，提示PKU患者精氨酸合成障碍。肝脏是鸟氨酸循环的重要器官，鸟氨酸循环又称“尿素循环”。是机体对氨的一种解毒方式。它的重要生物学意义是将体内蛋白质代谢产生的较高毒性的氨转化为低毒的尿素，从而排出体外。肝脏是哺乳类动物生成尿素的主要器官，由于精氨酸代琥珀酸合成酶(ASS)的作用使精氨酸水解为鸟氨酸及尿素。而精氨酸代琥珀酸合成酶是鸟氨酸循环的关键酶之一。通过进一步的研究发现PKU患者精氨酸代琥珀酸合成酶基因的启动子区域CpG岛呈甲基化状态，这也可能解释为精氨酸合成障碍的原因。CpG岛通常位于基因的启动子区或是第一个外显子区。健康人基因组中，CpG岛中的CpG位点通常是处于非甲基化状态，而在CpG岛外的CpG位点则通常是甲基化的。这种甲基化的形式在细胞分裂的过程中能够稳定的保留。表遗传学研究基因表达的变化，这种变化可通过减数分裂遗传，但不涉及有关基因DNA序列的改变。表观遗传是一种没有DNA序列变化并且可以遗传的基因功能变化。甲基化是表遗传修饰的一种重要形式，是基因型和表型间的重要纽带。DNA甲基化受到DNA甲基化转移酶的调控，并在细胞增殖分化的过程中，将基因的甲基化状态遗传给后代。真核生物DNA甲基化的差异，在基因表达的调节过程中以多种形式起着重要作用。随着DNA甲基化研究方法的不断发展和进步，人类正加快探索DNA甲基化的奥秘。DNA甲基化在遗传等疾病的研究中取得进展。甲基化已成为生物学研究的热点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用DNA甲基化的方法检测苯丙酮尿症的试剂盒。

本发明的目的还在于提供一种利用DNA甲基化的方法检测苯丙酮尿症的标志物。

本发明的目的还在于提供利用DNA甲基化的方法检测苯丙酮尿症的试剂盒的使用方法。

一种利用DNA甲基化的方法检测苯丙酮尿症的试剂盒，包括dNTP、10xPCR buffer、MgCl₂、ddH₂O、Taq DNA聚合酶、标准血液DNA、引物MSP-R、引物MSP-L、引物UMSP-R、引物UMSP-L、引物BSP-R1、引物BSP-L1、引物BSP-R2、引物BSP-L2；所述引物MSP-R的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNo.1所示，引物MSP-L的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示，引物UMSP-R的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示，引物UMSP-L的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.4所示，引物BSP-R1的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.5所示，引物BSP-L1的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.6所示，引物BSP-L2的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.7所示，引物BSP-R2的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.8所示；上述引物用于做甲基化特异性PCR，PCR时，引物的配对方案为：

引物MSP-R、MSP-L配对，引物UMSP-R、UMSP-L配对，引物BSP-R1、BSP-L1配对，引物BSP-R2、BSP-L2配对，用于检测ASS基因(GeneBankNG_011542，精氨酸代琥珀酸合成酶基因)启动子区甲基化情况。

所述标准血液DNA为取自无苯丙酮尿症健康人血液提取的基因组DNA并经过重亚硫酸盐处理。