[发明专利]通用方案和构象敏感凝胶电泳筛查单核苷酸多态性位点法

说明书

技术领域

本发明属临床个体基因型的测定方法，特别是涉及一种通用方案和构象敏感凝胶电泳筛查新单核苷酸多态性位点法。 

背景技术

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)作为第三代具有高度稳定性的遗传标记遗传标记，在基因定位、克隆、遗传多态性方面具有广泛应用，特别是作为基因诊断标记在预防医学中具有十分重要的作用，可以作为进行疾病诊断、预防和药物筛选的基础。目前筛选SNP和未知突变的主要方法有：单链构象多态性检测(single-strandconformation polymorphism analysis，SSCP)【Orita M，Iwahana H，Kanazawa H，Hayashi K，Sekiya T..Detection of polymorphisms of human DNA by gel electrophoresis as single-strandconformation polymorphisms.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1989，86(8)：2766-2770】，变性梯度凝胶电泳(denaturing gel gradient electrophoresis，DGGE)【Fischer，S.G.，Lerman，L.S.DNAfragments differing by single base-pair substitutions are separated in denaturing gradient gels：correspondence with melting theory.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1983，80(6)：1579-1583】，变性高效液相色谱技术(DHPLC)【Underhill PA，Jin L，Lin AA，Mehdi SQ，Jenkins T，Vollrath D，Davis RW，Cavalli-Sforza LL，Oefner PJ..Detection of numerous Y chromosome biallelicpolymorphisms by denaturing high-performance liquid chromatography.Genome Res，1997，7(10)：996-1005】，直接测序法等。这些方法在某种程度上均能完成对SNP的检测，但应用上也有些不足。SSCP影响因素很多，如电泳温度、胶中甘油浓度及胶浓度等均可影响检测的灵敏度，并且检测单碱基替换的敏感性较弱。DHPLC对试剂和环境要求较高。DGGE技术检测片段大于500bp，长度上优于其它方法，几乎可达100％的有效检测率，无需放射标记，但是当SNP发生在高熔点区时则难以利用DGGE技术检测。而对于一些比较小、外显子相对较少的基因的SNP可直接测序，其检测效率可以达到100％，但对于较大的外显子相对较多的基因，直接测序的成本较高。最近发展的荧光-构象敏感凝胶电泳法(fluorescence-based conformation sensitive gel electrophoresis，F-CSGE)步骤简单快速，高通量、低成本、可利用现有试验条件，无需添加新设备，可检测较长片段(～250-500bp)【LeungYF，Tam PO，Tong WC，Baum L，Choy KW，Lam DS，Pang CP.High-throughputconformation-sensitive gel electrophoresis for discovery of SNPs.Biotechniques，2001，30(2)：334-335，338-340】。由于该方法建立的基础为单碱基错配，所以在单碱基突变检 测中，与SSCP检测碱基替换较弱的敏感性(仅单链构象差异)相比，该方法具有更加明显的高敏感性。这也是CSGE技术用于SNP筛查的优势。但是，因为F-CSGE技术依赖荧光PCR过程，对每一对引物标记荧光成本较高。 

发明内容

本发明的目的是提供一种利用通用方案和构象敏感凝胶电泳技术筛查SNP位点的方法。该法通量更高、检测速度更快、成本更低地筛查人类或其他动物基因组中未知SNP的方法，可用于未知单碱基多态性、基因突变、单碱基插入或缺失等单碱基改变的筛查和确认，作为基因诊断标记应用于疾病诊断、预防和药物筛选。 

本发明的通用方案和构象敏感凝胶电泳筛查单核苷酸多态性位点法，包括下列步骤： 

(1)样本预处理