[发明专利]通用方案和构象敏感凝胶电泳筛查单核苷酸多态性位点法

权利要求书

1.一种利用通用荧光引物和构象敏感凝胶电泳筛查单核苷酸多态性SNP位点法，包括下列步骤：

(1)样本预处理

采用试剂盒抽提测试者全血或组织基因组DNA；

(2)PCR反应

设计一对通用荧光引物，根据样本靶序列设计N对特异性附加通用荧光序列的非荧光引物，通用引物标记HEX荧光，特异性引物无需添加荧光标记，通用引物和特异性引物于同一PCR体系里进行反应；

所述的通用荧光引物的序列为：

上游引物5’-TCACTTGCTTCCGTTGAGG-3’，

下游引物5’-GGTTTCGGATGTTACAGCGT-3’；

(3)构建异源双链

选取样本A作为对照样本，其余样本PCR产物分别与A样本PCR产物混合后，利用6步梯度逐次降温法于PCR扩增仪构建异源双链；

(4)配制构象敏感凝胶电泳CSGE温和变性胶与荧光-构象敏感凝胶电泳法F-CSGE检测SNPs；

(5)根据电泳峰型图分析判断SNP状态；

(6)DNA测序：在经F-CSGE发现SNP信号后，用DNA直接测序确定具体的变异类型。

2.根据权利要求1所述的利用通用荧光引物和构象敏感凝胶电泳筛查单核苷酸多态性SNP位点法，其特征在于：N对特异性附加通用荧光序列的非荧光引物中的N范围是1～10。

3.根据权利要求1所述的利用通用荧光引物和构象敏感凝胶电泳筛查单核苷酸多态性SNP位点法，其特征在于：所述步骤(2)中通用引物标记HEX荧光是用HEX荧光染料标记PCR通用引物5’端。

4.根据权利要求1所述的利用通用荧光引物和构象敏感凝胶电泳筛查单核苷酸多态性SNP位点法，其特征在于：所述步骤(2)中的PCR方法为通用引物PCR法。

5.根据权利要求1所述的利用通用荧光引物和构象敏感凝胶电泳筛查单核苷酸多态性SNP位点法，其特征在于：所述选取样本A作为对照样本为在总体样本中随机选取。

6.根据权利要求1所述的利用通用荧光引物和构象敏感凝胶电泳筛查单核苷酸多态性SNP位点法，其特征在于：所述步骤(3)中的6步梯度逐次降温法于PCR扩增仪构建异源双链是98℃5min；98℃→90℃5min；90℃→80℃5min；80℃→75℃10min；75℃→60℃10min；60℃→40℃20min；40℃→25℃20min，反应完成后半小时内电泳上样。

7.根据权利要求1所述的利用通用荧光引物和构象敏感凝胶电泳筛查单核苷酸多态性SNP位点法，其特征在于：所述步骤(4)中的配制CSGE温和变性胶步骤为

①配制50×聚丙烯酰胺母液

49.5g丙烯酰胺Acrylamide，0.5g双丙烯酰胺Bis-Acrylamide(BAP)，加双蒸水至100ml；

②配制10％聚丙烯酰胺胶

50ml 50×聚丙烯酰胺胶母液，37.5ml 15％甲酰胺，25ml 10×Tris-硼酸缓冲液，加137.5ml双蒸水，总体系250ml；

③胶体聚合

25ml 10％聚丙烯酰胺胶，250μL 10％过硫酸铵，13.5μL四甲基乙二胺TEMED，2小时凝固。

8.根据权利要求1所述的利用通用荧光引物和构象敏感凝胶电泳筛查单核苷酸多态性SNP位点法，其特征在于：所述步骤(4)中的电泳法步骤为

①377测序仪电泳环境

2kv，4hr，30℃，1×Tris-硼酸缓冲液；

②混样

0.5μLPCR产物，0.5μL荧光染料ROX，0.5μL 50mg/ml葡聚糖蓝，0.5μL新鲜的去离子甲酰胺；

③上样

毛细管吸取1.2-1.5μL上样。