[发明专利]一种丹参酮IIA诱导癌细胞HepG2凋亡的实验方法在审

专利信息
申请号: 201811339315.3 申请日: 2018-11-12
公开(公告)号: CN109432104A 公开(公告)日: 2019-03-08
发明(设计)人: 潘红莲 申请(专利权)人: 潘红莲
主分类号: A61K31/58 分类号: A61K31/58;A61P35/00;G16B50/00;G16B40/00;G16B45/00;G16B20/30;G16B35/20;C12N5/09;C12Q1/686;G01N33/68;G01N15/14
代理公司: 暂无信息 代理人: 暂无信息
地址: 313000 浙江省湖*** 国省代码: 浙江;33
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摘要: 发明公开了一种丹参酮IIA诱导癌细胞HepG2凋亡的实验方法,具体的实验过程如下:(1)实验材料准备;(2)细胞培养与处理;(3)RT‑PCR测定;(4)Western Blot测定;(5)Annexin V‑FITC染色;(6)生物信息数据库筛选与分析;(7)转录因子筛选测定;(8)Hoechst 33324染色;(9)体外动力学结合分析;(10)统计分析。本发明的有益条件在于:通过miR30b‑p53‑PTPN11/SHP2信号通路诱导来实现人肝癌细胞HepG2凋亡。
搜索关键词: 凋亡 诱导 丹参酮IIA 染色 癌细胞 细胞培养 生物信息数据库 筛选 人肝癌细胞 结合分析 实验材料 实验过程 信号通路 转录因子 统计分析 动力学 体外 分析
【主权项】:
1.一种丹参酮IIA诱导癌细胞HepG2凋亡的实验方法,其特征在于,具体的实验过程如下:(1)实验材料准备:丹参酮IIA(> 98.0%);p53,Bcl2和SHP2抗体;通过primer 5.0设计了Tp53,PTPN11,miR30a,b,c和d,Bax,Bcl2和p21的mRNA序列;Annexin V‑FITC染色试剂盒和3‑(4,5‑二甲基‑2‑噻唑基)‑2,5‑二苯基四唑溴化物(MTT)溶液;细胞培养基DMEM和胎牛血清(FBS);(2)细胞培养与处理:人肝癌细胞为HepG2和Hep3B,将细胞用含有10%胎牛血清、青霉素100U/mL、链霉素100μg/mL的DMEM培养液于37℃,5%CO2条件下培养,当汇合时,用一系列剂量的丹参酮IIA处理细胞,24小时后,收集培养基和细胞,并制备用于以下生物测定;(3)RT‑PCR测定:根据试剂盒说明从细胞中提取总RNA,通过Nano Drop测定RNA的质量,相应基因的扩增通过Applied Biosystems进行,通过2‑△△CT计算数据,并与空白样品相比分析每个基因的诱导倍数;(4)Western Blot测定:用具有1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解物分离总细胞蛋白,蛋白质浓度按照BCA试剂盒说明书的指导进行测定,在SDS‑10%聚丙烯酰胺凝胶上分离约50μg蛋白质,然后转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,在5%脱脂奶粉中封闭后,将膜与抗体在4℃下孵育过夜,第二天,将膜与第二抗体杂交,通过使用化学发光试剂观察蛋白质,并在ChemiScope上观察,并使用软件ChemiAnalysis来计算蛋白质条带的密度;(5)Annexin V‑FITC染色:收集细胞并用5μL Annexin V‑FITC和10μL PI染色,在黑暗中孵育至少5分钟后,通过流式细胞术分析凋亡细胞;(6)生物信息数据库筛选与分析:我们对59篇文献中所涉及到的部分基因进行了一下整理,过滤掉人意外物种的基因,修正基因symbol,过滤重复基因,最终得到61个基因,GeneCodis是一个整合了各种分析工具和数据的生物信息数据库,为大规模的基因或蛋白列表提供系统综合的生物功能注释信息,在此,我们使用GeneCodis对这61个基因集执行Go富集分析和信号通路功能注释,GeneMania数据库通过嵌入软件cytoscape能对61列表基因进行相关关系网络图谱绘制,61个选择的基因的网络由GeneMania自动产生并通过Cytoscape显现,Gene2Networks整合了十个哺乳动物相互作用网络数据集,相关图像的重建由Gene2Networks与Cytoscape进行,为了进一步确定丹参酮IIA影响的途径,我们在Cytoscape中绘制了相互作用网络图以便找出感兴趣的信号分子;(7)转录因子筛选测定:LASAGNA‑Search 2.0提供1792个转录因子模型和15个启动子检索物种是TF结合位点研究的网络工具,可在http://biogrid‑head.engr.uconn.edu/lasagna_search/ [LASAGNA‑Search2.0: 综合转录因子结合位点搜索和在浏览器中的可视化],在本研究中,我们使用LASAGNA‑Search 2.0筛选靶向基因的TF,在输入基因符号并选择物种作为人后,我们获得了TF的名称,我们的基因组的结合序列,结合位置,链,结合分数,p值和E值,在P<0.01时具有最大结合评分的序列被认为是靶向基因的结合位点;(8)Hoechst 33324染色:细胞中染色质的凝集是指示细胞毒性的一个毒理学终点,用一定剂量的丹参酮IIA作用24小时后,使用Hoechst‑33324染色HepG2细胞,室温下染20min,并用PBS洗涤两次,在Leica荧光显微镜下观察细胞的形态;(9)体外动力学结合分析:p53和PTPN11之间的结合亲和力的潜力在生物分子相互作用分析多层阵列HT上进行,将二十八个PTPN11序列,雷帕霉素(设定为阳性对照)和DMSO(阴性对照)印在3D光交联的小分子微阵列上,每个样品重复三次,将微阵列真空干燥,并在光交联剂中进行交联反应,用去离子水洗涤物理吸收,然后在使用前用N 2流干燥,在25℃下在加样缓冲液(PBS, pH = 7.4)中加载约650μL的系列浓度的p53(75, 150, 300, 600nM),结合和解离的租用时间为300秒,流速为2μL /秒,微阵列的表面通过Gly‑HCl(10mM, pH = 2.0)以3μL /秒的再生速率再生300秒,实验由Plexera SPRi系统实时监测,系统的响应与结合到小分子的蛋白质的质量正相关;(10)统计分析:利用SPSS17.0统计软件,计量资料呈正态分布且符合方差齐性,采用单因素方差分析,用均数±标准差(x±SD)表示,以P>0.05表示无统计学意义,P<0.05为差异有统计学意义,P<0.01表示有非常显著性统计学意义。
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