[发明专利]用于处理木质纤维素的酶、编码它们的核酸及其制备和应用方法

摘要

本发明提供了具有木质纤维素水解活性，例如，糖基水解酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、木糖苷酶(例如，β-木糖苷酶)、阿拉伯呋喃糖苷酶和/或葡萄糖氧化酶活性的多肽，编码这些多肽的多核苷酸以及制备和使用这些多核苷酸和多肽的方法。在一方面，本发明提供了能够酶促处理(水解)甘蔗渣的多肽，即用于甘蔗渣降解或用于生物质处理的多肽，和编码这些酶的多核苷酸以及制备和使用这些多核苷酸和多肽。在一种实施方式中，本发明提供了本发明的热稳定和耐热形式的多肽。本发明的多肽可以用于各种药物、农业和工业环境；例如，本发明提供了多酶系统，其能够水解糖工厂中处理的甘蔗的甘蔗渣成分中的多糖。本发明提供了用于将木质纤维素残余物生物转化成可发酵糖的酶；并且这些糖可以作为化学原料使用，用于生产乙醇和燃料，包括生物燃料如生物乙醇、生物丙醇、生物丁醇和生物柴油。

主权项

1.分离的、合成的或重组的核酸，其包括：(a)核酸序列(多核苷酸)，其与如下序列在至少大约20、30、40、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150或更多个残基，或cDNA、转录体(mRNA)或基因全长的区域内，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高或完全(100％)的序列同一性：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71、SEQID NO：73、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：81、SEQID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQID 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NO：711、SEQ ID NO：712、SEQID NO：713、SEQ ID NO：714、SEQ ID NO：715、SEQ ID NO：716、SEQ ID NO：717、SEQ ID NO：718和/或SEQ ID NO：720，其中所述核酸(多核苷酸)编码具有木质纤维素酶活性的多肽，或编码能够产生与如下序列特异性结合的抗体的多肽或肽：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ IDNO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ IDNO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ IDNO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ IDNO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ IDNO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQ IDNO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：74、SEQ IDNO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：84、SEQ IDNO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：94、SEQ IDNO：96、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：104、SEQID NO：106、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：122、SEQ IDNO：124、SEQ ID NO：126、SEQ ID 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NO：434、SEQ ID NO：436、SEQ ID NO：438、SEQ ID NO：440、SEQ ID NO：442、SEQ ID NO：444、SEQ ID NO：446、SEQ IDNO：448、SEQ ID NO：450、SEQ ID NO：452、SEQ ID NO：454、SEQ ID NO：456、SEQ ID NO：458、SEQ ID NO：460、SEQ ID NO：462、SEQ ID NO：464、SEQ IDNO：466、SEQ ID NO：468、SEQ ID NO：470和/或SEQ ID NO：472、SEQ ID NO：473、SEQ ID NO：474、SEQ ID NO：475、SEQ ID NO：476、SEQ ID NO：477、SEQ IDNO：478、SEQ ID NO：479、在SEQ ID NO：490至SEQ ID NO：700之间所有偶数编号SEQ ID NO：、SEQ ID NO：719和/或SEQ ID NO：721，和/或它们的酶促活性子序列(片段)，其中任选地，所述木质纤维素活性包括糖基转移酶、纤维素酶、纤维素分解活性、内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、β-木糖苷酶或阿拉伯呋喃糖苷酶活性，并且任选地，所述序列同一性通过运用了序列比较算法的分析或通过视觉观察来确定；并且任选地，所述序列比较算法包括BLAST版本2.2.2的算法，其中过滤设置被设置为blastall-p blastp-d″nr pataa″-F F，并且所有其它的选项被设为默认值；(b)在严格条件下与(a)的核酸杂交的核酸序列(多核苷酸)，其中所述核酸编码具有木质纤维素活性的多肽，并且任选地，所述木质纤维素活性包括糖基转移酶、纤维素酶、纤维素分解活性、内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、β-木糖苷酶或阿拉伯呋喃糖苷酶活性，并且所述严格条件包括洗涤步骤，所述洗涤步骤包括在0.2×SSC中在大约65℃的温度洗涤大约15分钟，并且任选地，所述核酸的长度是至少大约20、30、40、50、60、75、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更多个残基，或基因、cDNA或转录体(mRNA)的全长；(c)编码具有如下所示序列的多肽的核酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：74、SEQID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：84、SEQID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：94、SEQID NO：96、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：102、SEQ ID 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NO：721，或它们的酶促活性子序列(片段)；(d)，(a)、(b)或(c)所述的核酸(多核苷酸)，其编码具有至少一个保守氨基酸置换并保持其木质纤维素活性的多肽，其中任选地，所述保守氨基酸置换包括用相似性质的另一氨基酸置换氨基酸；并且任选地，保守置换包括：脂肪族氨基酸用另一个脂肪族氨基酸替代；丝氨酸用苏氨酸替代或相反；酸性残基用另一个酸性残基替代；带有酰胺基的残基用另一个带有酰胺基的残基替代；碱性残基与另一个碱性残基交换；或芳香族残基用另一个芳香族残基替代；(e)，(a)、(b)、(c)或(d)所述的核酸(多核苷酸)，其编码具有木质纤维素活性但缺少信号序列、前原结构域、锚定结构域和/或糖结合模块(CBM)的多肽，其中任选地，所述糖结合模块(CBM)包括纤维素结合模块、木质素结合模块、木糖结合模块、甘露聚糖酶结合模块、木葡聚糖特异的模块和/或阿拉伯呋喃糖苷酶结合模块，或由之组成；(f)，(a)、(b)、(c)、(d)或(e)所述的核酸(多核苷酸)，其编码具有木质纤维素活性的多肽并进一步包含异源序列；(g)，(f)所述的核酸(多核苷酸)，其中所述异源序列包括这样的序列或由这样的序列组成，该序列编码：(i)异源信号序列、异源糖结合模块、异源锚定结构域、异源催化结构域(CD)或它们的组合；(ii)，(i)所述的序列，其中所述异源信号序列、糖结合模块或异源催化结构域(CD)从异源木质纤维素酶得到；或(iii)标签、表位、靶向肽、可剪切序列、可检测部分或酶；(h)，(g)所述的核酸(多核苷酸)，其中所述异源糖结合模块(CBM)包括如下模块或由如下模块组成：纤维素结合模块、木质素结合模块、木糖结合模块、甘露聚糖酶结合模块、木葡聚糖特异模块和/或阿拉伯呋喃糖苷酶结合模块；(i)，(g)所述的核酸(多核苷酸)，其中所述异源信号序列将所编码的蛋白质靶向液泡、内质网、叶绿体或淀粉颗粒；或(j)，与(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(g)、(g)、(h)或(i)完全(全部)互补的核酸序列(多核苷酸)。