本发明提供了一种无乳糖常温酸奶及其制备方法。该制备方法包括牛奶预处理、配料、均质、一次杀菌、发酵、二次杀菌、灌装的步骤,其中,发酵采用的发酵剂包括添加量大于等于100AU/T的嗜热链球菌AiBi S 4.01 SWEET,所述发酵的温度为29‑31℃,所述发酵的时间为23‑25h。本发明还提供了一种无乳糖常温酸奶,其是由上述制备方法得到的,其中,所述无乳糖常温酸奶的乳糖含量低于0.5g/100g。本发明提供的制备方法能够使原料中的乳糖在发酵过程中被充分水解为葡萄糖和半乳糖,减少了外源乳糖酶的添加和糖类的添加,从而降低成本、使产品标签更清洁,符合低糖、低脂的健康选择。