[发明专利]一种午餐肉罐头成品的非洲猪瘟病毒检测方法在审
| 申请号： | 202210124669.6 | 申请日： | 2022-02-10 |
| 公开（公告）号： | CN114480736A | 公开（公告）日： | 2022-05-13 |
| 发明（设计）人： | 王榕莉;张文捷;钱文静 | 申请（专利权）人： | 上海梅林食品有限公司 |
| 主分类号： | C12Q1/70 | 分类号： | C12Q1/70;C12Q1/686 |
| 代理公司： | 上海互顺专利代理事务所(普通合伙) 31332 | 代理人： | 韦志刚;曹月明 |
| 地址： | 200082 *** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 午餐肉 罐头 成品 非洲 猪瘟 病毒 检测 方法 | ||
【说明书】：
本发明涉及一种午餐肉罐头成品的非洲猪瘟病毒检测方法。该检测方法主要包括将待测物置于荧光PCR仪，进行如下反应：37℃孵育2min；95℃预变性20s；95℃变性10s，58℃延伸20s，共40个循环；设置58℃收集FAM荧光信号；进行结果判定，阳性对照应出现扩增曲线且Ct值35，阴性对照无。样品的扩增结果若有典型的扩增曲线，Ct值40可判定为阳性。本方法开发了独特的原料预处理和基因提取流程，之后将提取产物进行常规的PCR反应即可检测非洲猪瘟病毒。
技术领域
本发明涉及一种午餐肉罐头成品的非洲猪瘟病毒检测方法。
背景技术
近几年非洲猪瘟疫情形势严峻，我公司主要以生猪肉为原料，生产猪肉制品罐头，如午餐肉、西式火腿等。而国家标准《非洲猪瘟诊断技术GB/T18648-2020》主要针对生猪肉进行诊断和病毒检测。从我公司的实际出发，如果要针对成品罐头进行非洲猪瘟病毒检测，不能直接套用国标的流程。
发明内容
本发明的目的是为解决现有技术的不足，提供了一种午餐肉罐头成品的非洲猪瘟病毒检测方法，
(1)取0.1g-0.2g待测午餐肉于离心管，加入生理盐水，混匀后取上清液，放入96孔板，加入蛋白酶K裂解剂；
(2)混合磁珠悬浮液，经过磁吸混合，进行DNA提取；
(3)加入漂洗液进行漂洗；
(4)用无核酸酶水进行洗脱，得到待测核酸
(5)取待测核酸，放入离心管，加入缓冲液，涡旋混匀3-5次；
(6)涡旋混匀后，取上清液，为待检DNA；
(7)将引物探针和酶反应液瞬时离心后混合，颠倒混匀5-10次，所得为PCR反应液；
(8)取PCR反应管，加入PCR反应液，将阴性对照、待检DNA、阳性对照分别加到不同的PCR反应管中；
(9)加样后瞬时离心，置于荧光PCR仪，进行如下反应：37℃孵育2min；95℃预变性20s；95℃变性10s，58℃延伸20s，共40个循环；设置58℃收集FAM荧光信号；
(10)进行结果判定，阳性对照应出现扩增曲线且Ct值35，阴性对照无。样品的扩增结果若有典型的扩增曲线，Ct值40可判定为阳性。
所述缓冲液为磷酸钾、磷酸锌、磷酸钠中的一种或几种。
所述漂洗液70-80wt％的乙醇水溶液。
所述检测方法检测前，将罐头易拉盖用酒精消毒。
所述检测方法的取样步骤如下：
打开罐头，将内容物倒出后，用切片机切成匀称的薄片取靠近中间一片，在该片肉上取下约0.1g-0.2g，要注意取下的肉要有代表性，不能取夹花、肥肉或是胶冻。
所述检测方法的步骤(2)-(4)，采用使用自动核酸提取仪进行自动操作。
所述检测方法的步骤(6)-(10)，采用成品PCR检测试剂盒进行检测。
现有非洲猪瘟病毒检测方法开发时只考虑到诊断生猪肉，如果用该方法检测午餐肉罐头成品，检测结果会因为罐头成品中的其他成分，如淀粉、卡拉胶，产生干扰和误差，并可能出现假阳性。因此本方法开发了独特的原料预处理和基因提取流程，之后将提取产物进行常规的PCR反应即可检测非洲猪瘟病毒。
参考以下详细说明更易于理解本申请的上述以及其他特征、方面和优点。
具体实施方式
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- 本发明涉及一种高危型人乳头瘤病毒分型检测的引物探针组及其应用、试剂盒及检测方法。本发明提供的试剂盒中包含特异性引物探针组，并对反应体系进行合理优化，保证了对高危型人乳头瘤病毒分型检测的灵敏度和特异性，使其更加贴合对受试者尿液样本的检测。试剂盒中包含的标准品可以辅助完成对人乳头瘤病毒高危型别进行分型定量检测，搭配不受采样手法的不同而影响质量的尿液样本，能保证细胞量维持在一个相对均衡的水平，使定量检测的结果更有意义。同时，本发明提供的检测方法能够对受检者体内HPV病毒进行定量检测，从而观察受检者体内在一定时间段内病毒型别与载量的变化情况，从而给予临床医生更多帮助，有利于医生出具针对性的治疗方案。
- 一种RT-qPCR检测黄瓜花叶病毒的方法-202311143956.2
- 刘艳梅 - 南昌师范学院
- 2023-09-06 - 2023-10-24 - C12Q1/70
- 本发明公开了一种RT‑qPCR检测黄瓜花叶病毒的方法，涉及生物技术领域。该方法包括以下步骤：(1)提取得到待检样品的总RNA，之后反转录得到cDNA；(2)以所述cDNA为模板，利用特异性引物对进行RT‑qPCR反应，根据Ct值判断所述待检样品中是否含有黄瓜花叶病毒：当15Ct值35时，为阳性，即为含有所述黄瓜花叶病毒；当Ct值≥35时，为阴性，即为不含有所述黄瓜花叶病毒。本发明针对黄瓜花叶病毒基因组编码外壳蛋白的基因保守区域，设计了特异性强的RT‑qPCR检测引物，并建立了一种高效的RT‑qPCR检测方法，可为黄瓜花叶病毒的准确高效监测防控提供了技术支持。
- 适用于15种植物检疫病毒的靶向测序建库及检测方法-202210150996.9
- 毛凌峰;孙凯;尹传林;俞晓平 - 杭州柏熠科技有限公司
- 2022-02-18 - 2023-10-24 - C12Q1/70
- 本发明提供一种适用于15种植物检疫病毒的靶向测序建库及检测方法，设计针对15种植物检疫病毒的特异引物池，并将特异性多重反转录技术与纳米孔技术相结合，建立针对15种植物检疫病毒的靶向捕获测序方法，具备高灵敏度、高通量、低成本的优点，可实现单次建库测序检测15种植物检疫病毒的目标，可解决目前植物病毒检疫存在的检测通量低、检测目标单一的问题。
- 检测BK病毒的方法和组合物-201910529553.9
- F·陈;L·I·孔;J·陈;M·捷纳提保 - 焦点诊断公司
- 2006-07-25 - 2023-10-24 - C12Q1/70
- 本发明提供了用于快速、灵敏和高度特异性地基于核酸(例如，基于DNA)检测样品中的BK病毒的方法和组合物。一般地，所述方法涉及检测具有BK病毒基因组保守区域的靶序列的靶核酸。本发明也表征了用于本发明方法的组合物和试剂盒，所述组合物包括引物、探针。
- 猫杯状病毒灭活抗原的毒价检测方法及应用-202310790990.2
- 朱旭;郝鹏;张燕红;王艳杰;张海宝;韩冬;李晓燕;孟书丽;赵嘉楠;赵飞飞;高晓宇;吴孟楠;李培艳;燕成义;杨晶;乌恩宝音;海丽丽;段可欣 - 金宇保灵生物药品有限公司;金宇共立动物保健有限公司
- 2023-06-29 - 2023-10-20 - C12Q1/70
- 本发明涉及微生物检测技术领域，尤其涉及一种猫杯状病毒灭活抗原的毒价检测方法及应用。所述猫杯状病毒灭活抗原的毒价检测方法包括如下步骤：使用灭活剂处理猫杯状病毒液，得到灭活抗原液；使用透析袋去除所述灭活抗原液中的灭活剂，得到纯化灭活抗原；所述透析袋的规格为80‑200kd；所述透析袋的透析时间为5‑12h；测定所述纯化灭活抗原的毒价。所述方法通过透析袋透析灭活剂处理后的灭活抗原，能精准的控制灭活剂的处理时间，进而缩短灭活周期。且使用透析袋可以去除灭活剂残留，在进行灭活检验时，不会因为灭活剂残留而影响灭活结果的判定。本发明所述方法无需多次抗原传代，即可获得抗原的灭活检验结果。
- 引物组和探针、试剂盒、检测猪流行性腹泻病毒野毒株和疫苗株的方法-202311144718.3
- 刘志成;勾红潮;沈海燕;张春红;乌日尼乐;聂晶晶;瞿云芝;张建峰 - 广东省农业科学院动物卫生研究所
- 2023-09-06 - 2023-10-20 - C12Q1/70
- 本发明属于生物技术领域，公开了一种引物组和探针，包含核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1‑6所示的FIP、BIP、F3、B3、LoopF和LoopB组成的引物组以及如SEQ ID NO：7‑8所示的荧光探针probe和淬灭探针Quencher，该引物组能够对猪流行性腹泻病毒野毒株、疫苗株均进行扩增，对于野毒株的ORF3基因保守区域开发出荧光引物，用于进行荧光的特征性反应，实现了对猪流行性腹泻病毒野毒株和疫苗株的高特异性、敏感性的快速定量检测。同时，本发明还提供了一种试剂盒、检测猪流行性腹泻病毒野毒株和疫苗株的方法。
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