[发明专利]检测鹅星状病毒和鹅嵌杯病毒的引物对、试剂盒及方法

说明书

本发明涉及检测鹅星状病毒和鹅嵌杯病毒的引物对、试剂盒及方法。本发明的引物对包括GoAstV上游引物、GoAstV下游引物、GoCV上游引物和GoCV下游引物，分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所述。本发明的试剂盒包括前述的引物对。本发明方法包括步骤：S1、提取样品RNA；S2、采用前述引物对，使用双重一步法RT‑PCR反应程序扩增后检测；若452 bp处出现条带，则鹅星状病毒阳性，若711 bp处出现条带，则鹅嵌杯病毒阳性。本发明方案用于鹅星状病毒和鹅嵌杯病毒的分子流行病学检测，特异性好，结果可靠。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种检测鹅星状病毒和鹅嵌杯病毒的引物对、试剂盒及方法。

背景技术

鹅星状病毒(Goose astrovirus，GoAstV)是一种无囊膜，单股正链RNA病毒。GoAstV 粒子呈20面体对称结构，直径在28nm-30nm之间，基因组长度7148-7299bp之间。GoAstV 是引起鹅致死性痛风的主要病原之一，临床主要表现为精神沉郁，卧地倦动，采食减少，剖检表现为内脏器官及关节腔的严重尿酸盐沉积，给养殖业带来巨大的经济损失，是目前危害世界养鹅业的重要疫病之一。该病毒广泛存在于我国的养殖鹅群中，严重影响了养鹅业的经济效益。

鹅嵌杯病毒(Goose calicivirus，GoCV)是一种新出现的水禽嵌杯病毒，是嵌杯病毒科成员，病毒粒子呈球形或近球形，直径为28nm-30nm，具有特征性的20面体对称单层衣壳结构，为无囊膜正链RNA病毒，于2012年首次在我国的鹅群中检测发现。GoCV是引起鹅病毒性肠炎与传染性生长阻滞综合征的主要病原之一，临床主要表现为腹泻，生长迟缓、营养不良，与GoAstV混合感染后可加强临床表现，严重威胁着养鹅业的健康发展。由于GoAstV与GoCV感染鹅以后的临床表现、病理变化等非常相似，给临床诊断造成了一定困难。

目前，用于GoAstV与GoCV的检测方法，有电镜观察、宏基因组测序和RT-PCR等，但由电镜操作与宏基因组测序需要一定技能，不易进行大量样本的集中处理，同时仪器费用高，所以电镜检测与宏基因组测序在GoAstV与GoCV监测中存在很大局限性。

RT-PCR(reverse transcription-Polymerase Chain Reaction，中文全称为反转录聚合酶链式反应)这种先进的分子生物学检测手段，不仅可以快速准确的检测病原，而且其检测方法特异性强、敏感性高。RT-PCR的基本原理为：在引物的作用下，先对RNA样品进行cDNA 合成，再进行PCR扩增。尽管RT-PCR方法得到了广泛应用，但单重RT-PCR方法一个反应只能检测一种病毒，不能进行多种病毒类型的联合RT-PCR检测。多重PCR(Multiplex PCR)是在同一PCR反应体系中加入两对以上的引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，它具有高效快捷、高度特异敏感、降低实验成本、加速实验进程等优点，更适合在临床中应用。一步法RT-PCR即逆转录和PCR在同一反应体系中连续进行，因为在cDNA合成和扩增之间不需要打开管盖，反应中途不需要添加任何试剂，简化了实验操作步骤，所以一步法RT-PCR 在处理大量样品时具有明显的优势；而且一步法RT-PCR逆转录所得的cDNA全部用于PCR 扩增，故可以得到更高的灵敏度，基于以上特点，双重一步法RT-PCR在临床检测应用中将有显著的优势。

综上所述，现在亟需研发出一种可以同时检测鹅星状病毒和鹅嵌杯病毒的引物对、试剂盒及方法，以实现快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好地检测家禽养殖时的鹅星状病毒和鹅嵌杯病毒，为准确鉴别鹅感染的病因并对症下药，对鹅养殖行业健康发展意义重大，填补国内外相关领域空白。

发明内容：

本发明所要解决的首要技术问题是提供一种同时检测鹅星状病毒和鹅嵌杯病毒的引物对，该组引物灵敏度好、特异性高，利用该组引物能对能联合检测鹅星状病毒和鹅嵌杯病毒。