[发明专利]一种经改造的萤光素酶突变体蛋白、生物发光探针、探针组、制备方法和检测方法

说明书

本发明一种经改造的萤光素酶突变体蛋白、生物发光探针、探针组、制备方法和检测方法，属于分子生物学技术领域。本发明提供的一种经改造的萤光素酶突变体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的经改造的萤光素酶突变体蛋白是将萤光素酶蛋白166位点的半胱氨酸突变为丝氨酸，并在萤光素酶的C‑末端添加半胱氨酸得到，通过对萤光素酶蛋白的改造实现了其与DNA分子的可控、等比例共价偶联，从而构建了可对核酸产生响应的高信噪比生物发光探针，实现了对核酸分子的精确传感，解决了生物发光传感技术难以在核酸分子上进行应用的难题。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种经改造的萤光素酶突变体蛋白、生物发光探针、探针组、制备方法和检测方法。

背景技术

MicroRNAs(miRNAs)是一类长度在22～25nt范围内的小分子RNA，其不仅参与了细胞分化等重要的生物学过程，同时也是肿瘤等重大疾病的关键标志物分子。目前，已建立了基于电化学、荧光、化学发光等传感原理的miRNAs检测方法。然而，现有方法仍存在操作繁琐、易受环境因素干扰、检测设备成本较高的问题。

相对于传统检测技术，生物发光传感具有信噪比高、光毒性小、不受外部激发光源和自荧光干扰的优势，因此已在生物医学分析领域得到了一定的应用。目前，生物发光传感技术已成功应用于蛋白质、细胞等生物标志物的检测，但是其在核酸标志物如microRNAs检测中的应用仍十分有限。造成上述问题的主要原因在于：产生生物发光的萤光素酶无法直接对核酸含量和结构的变化产生实时、准确的响应。以上问题制约了生物发光在核酸标志物检测中的应用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种经改造的萤光素酶突变体蛋白、生物发光探针、探针组、制备方法和检测方法。本发明提供的经改造的萤光素酶突变体蛋白能够制备成基于DNA链置换的生物发光探针可实现对核酸分子的精确传感，从而建立了一种针对miRNAs的高灵敏度、高准确性的检测技术。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一种经改造的萤光素酶突变体蛋白，所述经改造的萤光素酶突变体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供了上述技术方案中所述的经改造的萤光素酶突变体蛋白的制备方法，包括如下步骤：将萤光素酶第166位点的半胱氨酸突变为丝氨酸，并在蛋白的C-末端添加含有半胱氨酸位点的连接区域，得到编码经改造的萤光素酶突变体蛋白的DNA；将编码经改造的萤光素酶突变体蛋白的DNA插入质粒载体中，得到重组质粒；将得到的重组质粒转入大肠杆菌中，得到重组大肠杆菌；培养所述重组大肠杆菌，得到所述经改造的萤光素酶突变体蛋白。

优选的，所述质粒载体包括pET-25(b+)、pET-26(b+)、和pET-30(b+)中的一种。

优选的，所述大肠杆菌包括BL21(DE3)、BL21(DE3)pLyS、Rosetta(DE3)、和Origima(DE3)中的一种。

本发明提供了一种检测核酸分子的生物发光探针，所述生物发光探针的制备用原料包括上述技术方案中所述的经改造的萤光素酶突变体蛋白和双链DNA分子；

所述双链DNA分子包括第一链和第二链两条链，所述第一链的核苷酸序列如SEQID NO.3所示，所述第二链的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述第一链的5'端修饰有氨基基团，所述第二链的3'端修饰有发光猝灭基团Dabcyl。

本发明提供了上述技术方案中所述的生物发光探针的制备方法，包括如下步骤：将上述技术方案中所述的经改造的萤光素酶突变体蛋白与双链DNA分子共价偶联，得到所述生物发光探针。

优选的，所述共价偶联的交联剂包括SMCC。