[发明专利]全基因组范围的植物基因功能鉴定的方法

摘要

本发明涉及全基因组范围的植物基因功能鉴定的方法，包括：1)将出发植物进行单核苷酸突变，构建植物突变体库；2)检测步骤1)所述植物突变体库中突变体的表型，构建植物突变体表型数据库；3)检测步骤2)所述植物突变体库中突变体的基因型，构建植物突变体基因型数据库；4)结合植物突变体表型数据库和植物突变体基因型数据库，确定出发植物中由所述单核苷酸突变导致的SNP位点所在基因的功能。本发明建立的植物突变体表型数据库和突变体基因型数据库，可以精确、迅速地找到与植物发育过程、抗逆反应或代谢途径等生物学过程相关的基因，为植物功能基因组研究开创了新途径。

主权项

1.全基因组范围的玉米基因功能鉴定的方法，其特征在于，包括如下步骤：A、对玉米进行单核苷酸突变，构建玉米突变体库；B、检测步骤A所述玉米突变体库中突变体的表型，构建玉米突变体表型数据库；C、检测步骤B所述玉米突变体库中突变体的基因型，构建玉米突变体基因型数据库；D、结合步骤B所述玉米突变体表型数据库和步骤C所述玉米突变体基因型数据库，确定所述玉米中由所述单核苷酸突变导致的SNP位点所在基因的功能；步骤A具体如下：（1）收集玉米的花粉，进行化学诱变处理，得到诱变后植物花粉；（2）将步骤（1）得到的诱变后植物花粉涂抹在所述玉米的花丝上，得到授粉后玉米；（3）步骤（2）得到的授粉后玉米经生长、结实，收获种子，得到M1代种子，种植M1代种子，得到M1代玉米突变体，即构建得到玉米突变体库；步骤B具体如下：（4）将步骤（3）得到的M1代玉米突变体自交，得到M2代植株；（5）检测步骤（4）得到的M2代植株不同发育时期的表型，构建玉米突变体表型数据库；步骤C具体如下：（6）分别提取步骤（3）得到的每株M1代玉米突变体的基因组DNA；（7）将步骤（6）得到的每株M1代玉米突变体的基因组DNA片段化，构建二代测序文库，用玉米外显子探针富集外显子区域，测序，获得每株M1代植物突变体的外显子DNA序列；（8）分别将步骤（7）得到的每株M1代植物突变体的外显子DNA序列与玉米的基因组DNA序列比对，找出每株M1代植物突变体中的SNP位点，确定所述SNP位点所在基因的位置，将每株M1代植物突变体及其SNP位点所在基因的位置构成玉米突变体基因型数据库；步骤D具体包括如下方案Ⅰ或Ⅱ：方案Ⅰ包括如下步骤：（10）在步骤B中的所述玉米突变体表型数据库中找出具有同类表型的M2代玉米对应的M1代植物突变体；（11）在步骤C中的所述玉米突变体基因型数据库中找出每株步骤（10）所述具有同类表型的M1代植物突变体的SNP位点所在的基因，分析所述玉米突变体基因型数据库和所述玉米突变体表型数据库之间的连锁关系，如果所述SNP位点所在基因相同，则所述SNP位点所在的基因是与所述表型相关的基因；方案Ⅱ包括如下步骤：（12）在步骤C中的所述玉米突变体基因型数据库中找到目标基因中所有能导致基因编码蛋白改变的SNP位点对应的M1代植物突变体；（13）在步骤B中的所述玉米突变体表型数据库中找到步骤（12）中每个M1代植物突变体对应的M2代植物的所有表型，如果表型相同，则所述目标基因为是与所述表型相关的基因；具体地，步骤A中将花粉与甲基磺酸乙酯溶液按g:ml=1:50‑150的比例混合40‑50min，得到诱变后植物花粉；所述甲基磺酸乙酯溶液的浓度为0.08‑0.12 v/v%；步骤C中在测序前包括对基因组DNA进行超声破碎，回收200‑400 bp DNA片段的步骤；步骤C中在超声破碎后测序前还包括如下步骤：a)将所述200‑400 bp DNA片段进行DNA末端修复，得到末端修复DNA；其中，100μl DNA末端修复的反应体系为：30μl所述200‑400 bp DNA片段、4μl 0.4mM dNTP Mix、1μl Klenow酶、5μl T4 DNA聚合酶、5μl T4 PNK、10μl 10×T4 DNA连接酶缓冲液，10μl 1mM ATP，用ddH₂O补足至100μl；DNA末端修复的反应温度为20ºC，反应时间为30分钟；b)将步骤a）得到的末端修复DNA 3’末端加A，得到3’末端加A的DNA；其中，50μl 3’末端加A的反应体系为：32μl末端修复DNA、3μl Klenow Exo‑酶、5μl 10×Klenow酶缓冲液、10μl 1mM ATP；3’末端加A的反应温度为37ºC，反应时间为30分钟；c）将步骤b）得到的3’末端加A的DNA连接接头，回收300‑500bp的片段，即为接头DNA；其中，接头序列如下：5'‑GATCGGAAGAGCACACGTCT‑3’5'‑ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT‑3’；d)将步骤c）得到的接头DNA进行PCR扩增，回收300‑500bp的目的片段，得到全基因组测序文库；e) 将步骤d）得到的全基因组测序文库用玉米外显子探针捕获，得到外显子组测序文库；其中，PCR扩增使用的模板为所述接头DNA，使用的引物序列分别如SEQ ID NO:3‑16所示。