[发明专利]一种经改造的萤光素酶突变体蛋白、生物发光探针、探针组、制备方法和检测方法有效
| 申请号： | 202110367329.1 | 申请日： | 2021-04-06 |
| 公开（公告）号： | CN113025586B | 公开（公告）日： | 2022-10-04 |
| 发明（设计）人： | 倪维 | 申请（专利权）人： | 湖北省中医院 |
| 主分类号： | C12N9/02 | 分类号： | C12N9/02;C12N15/53;C12N15/70;C12N15/11;C12N1/21;C12Q1/6844;C12Q1/66;C12R1/19 |
| 代理公司： | 北京高沃律师事务所 11569 | 代理人： | 张梦泽 |
| 地址： | 430061 *** | 国省代码： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 改造 萤光 突变体 蛋白 生物 发光 探针 制备 方法 检测 | ||
1.一种经改造的萤光素酶突变体蛋白，其特征在于，所述经改造的萤光素酶突变体蛋
白的氨基酸序列如SEQ ID NO .1所示。
2.权利要求1所述的经改造的萤光素酶突变体蛋白的制备方法，包括如下步骤：将萤光素酶第166位点的半胱氨酸突变为丝氨酸，并在萤光素酶的C-末端添加含有半胱氨酸位点的连接区域，得到编码经改造的萤光素酶突变体蛋白的DNA，所述编码经改造的萤光素酶突变体蛋白的DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO .2所示；将编码经改造的萤光素酶突变体蛋白的DNA插入质粒载体中，得到重组质粒；将得到的重组质粒转入大肠杆菌中，得到重组大肠杆菌；培养所述重组大肠杆菌，得到所述经改造的萤光素酶突变体蛋白。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述质粒载体包括pET-25b(+)、pET-26b(+)和pET-30b(+)中的一种。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述大肠杆菌包括BL21(DE3)、BL21
(DE3)pLysS、Rosetta(DE3)和Origami(DE3)中的一种。
5.一种检测核酸分子的生物发光探针，其特征在于，所述生物发光探针的制备用原料
包括权利要求1所述的经改造的萤光素酶突变体蛋白和双链DNA分子；
所述双链DNA分子包括第一链和第二链两条链，所述第一链的核苷酸序列如SEQ ID
NO.3所示，所述第二链的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述第一链的5 '端修饰有氨基基团，所述第二链的3 '端修饰有发光猝灭基团Dabcyl。
6.权利要求5所述的生物发光探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求1所述的经改造的萤光素酶突变体蛋白与双链DNA分子共价偶联，得到所述生物发光探针。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述共价偶联的交联剂包括SMCC。
8.检测核酸分子的探针组，其特征在于，所述探针组包括权利要求5所述的生物发光探针和单链DNA探针；所述单链DNA探针包括触发生物发光响应的序列和识别靶标核酸分子的序列，所述触发生物发光响应的序列的核苷酸序列如SEQ ID NO .5。
9.一种检测核酸分子的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求8所述的探针组。
10.一种检测核酸分子的检测方法，其特征在于，将靶标核酸分子和单链DNA探针混合进行扩增，得到扩增产物；将扩增产物与权利要求5所述的生物发光探针共孵育，得到孵育后的产物；在得到的孵育后的产物中添加萤光素酶底物，通过酶标仪完成生物发光的检测，实现靶标核酸分子的定量分析。
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