[发明专利]一种基于CRISPR/Cas12a点切割可视化检测植原体的方法

说明书

本发明公开了一种基于CRISPR/Cas12a点切割可视化检测植原体的方法，该方法通过设计针对植原体16SrDNA序列保守区域的crRNA，激活CRISPR/Cas12a的蛋白的切口功能实现对linker‑arm DNA的切割，以产生所需要的断裂DNA片段，并利用纳米金显色技术成功检测出多种植原体，这对实现植原体田间快速可视化检测具有重大意义。本发明具有成本低，操作简便，效率高，灵敏度高和特异性强等特性，并且通过显色即可肉眼判断，显色反应效果持久明显。减少了对实验室大型仪器和精密信号采集仪器的依赖，为植原体的检测提供了新思路和新选择。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及采用生物学的方法对植原体进行检测，更具体涉及一种基于CRISPR/Cas12a点切割可视化检测植原体的方法。

背景技术

植原体(phytoplasma)是一种专性寄生于植物韧皮部筛管细胞的类菌原体。在世界范围内引起上千种植物的病害发生。植物感染植原体后，表现出丛枝、小叶簇生、植株矮化、花器官畸形及花变叶等异常发育表型，严重时整株枯死。由于植原体专性寄生在植物韧皮部筛管细胞，由于生长条件苛刻无法离体培养，植原体病害目前仍缺乏有效的治疗手段。植物一旦感染植原体，很难挽回损失，在缺乏有效治疗手段的背景下，植原体的检测是防治植原体病害的关键环节。因此建立起简便，灵敏，快速和准确的植原体检测体系对防治植原体病害具有重要意义。

在缺乏有效治疗手段的背景下，植原体的检测是防治植原体病害的关键环节。随着分子生物学技术的发展，植原体的检测技术发展迅速。目前植原体的检测手段主要包括电子显微镜检测，组织化学法检测，血清学检测，分子生物学检测等方法。电子显微镜法和血清法结果准确可信，但是操作复杂且对样本质量要求高。组织化学法成本低廉，操作简便但准确性和灵敏性较低。分子生物学检测是目前植原体检测中最为常用的检测手段。具有灵敏性高，结果准确等优点。但是无法脱离实验室大型设备且检测时间较长。因此建立起灵敏，准确，快速的田间检测方法是未来植原体检测领域的研究方向。近年来，CRISPR/Cas系统作为一种基因工程中非常重要的工具被广泛应用于基因编辑、基因表达调控及基因检测等研究中。最近的进展表明，CRISPR相关(Cas)内切核酸酶系统，如Cas12a、Cas13a和Cas14，均具有可用于核酸检测的特征(Chen et al，2018；Gootenberg et al.，2017；Harringtonet al.，2018)。而CRISPR/Cas12a系统可以作为识别切割DNA片段的理想手段，当Cas12a/crRNA/靶DNA三元复合物形成时，Cas12a具有DNA激活的一般DNase活性，可以非特异切割任何DNA片段(Chen et al.，2018；Li et al.，2018)。

发明内容

针对现状，本发明提供一种基于CRISPR/Cas12a点切割可视化检测植原体的方法，旨在解决传统植原体检测中成本高、对实验室设备高度依赖性、要求检测人员具有较深的专业知识等问题，使植原体的田间可视化检测成为可能。

本发明的目的之一在于提供一种识别植原体16SrDNA序列保守区域的crRNA。

本发明的目的之二在于提供用于等温扩增植原体16SrDNA片段的RPA引物。

本发明的目的之三在于提供用于CRSPR/Cas12a切割体系的linker-arm DNA。

本发明的目的之四在于提供一种通过纳米金显色原理检测植原体的方法。

为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：

一种基于CRISPR/Cas12a点切割可视化检测植原体的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)设计合成crRNA的引物序列，制备针对植原体16SrDNA序列保守区域的crRNA；