[发明专利]一种扁座壳孢发酵生产蛋白酶的培养基及方法

说明书

技术领域

本发明涉及真菌的发酵培养基及工艺。更具体地，本发明涉及一种扁座壳孢发酵生产蛋白酶的培养基及方法。 

背景技术

蛋白酶是一类可以催化蛋白质水解反应的酶，它广泛存在于各种生物体中，不仅对生物体蛋白质的新陈代谢起调节作用，从细胞水平、器官水平和机体水平，呈现多种多样的功能。它们参与细胞的正常生理以及异常的病理条件下的诸如蛋白质水解、细胞生长和迁移、酶原激活、激素释放等各种复杂的过程（汪章勋等，2005）。蛋白酶在食品、化工、医疗、农业、环保等许多方面发挥重要的作用，例如可用做生物农药的虫生真菌，其蛋白酶活力与其毒力密切相关（Paoletti, 200）。 

扁座壳孢(Aschersonia placenta)是一类重要的虫生真菌，隶属于子囊菌门、粪菌纲、肉座菌目、麦角菌科、座壳孢属，在对粉虱、介壳虫等一些刺吸式口器害虫的自然控制中发挥着重要作用，具有可持续大面积控制害虫，对环境影响小等优点，是一种很有潜力的资源菌（邱君志等，2004）。 

国外也有许多国家在用扁座壳孢防治粉虱均取得上成功，如荷兰、捷克斯洛伐克用芽生孢子通过液体发酵培养进行小规模试验生产，以防治白粉虱，也取得了成功（邱君志等，2005）。迄今为止，有些国家已经开发出粉虱扁座壳孢菌的制剂，并将其商业化，用于粉虱的防治（李增智等，1987）。扁座壳孢菌作为微生物农药具有对生态环境影响小、成本低、选择性强、对人畜安全等特点，具有光明的前景（邱君志等，2004），但是它还具有杀虫效果慢、受外界条件影响大等缺点，因此必须对其作用于害虫的机理进行深入研究，进而取得能克服上述两个缺点的优良菌株以应用于生产运用中。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种扁座壳孢发酵生产蛋白酶的培养基及方法。 

本发明首先提供了一种扁座壳孢发酵生产蛋白酶的培养基，所述培养基的原料含麸皮或者甘油1w%，酵母粉或者酵母膏1 w %，Mn²⁺或者Mg²⁺4×10^-4mol/L，培养基初始pH= 7.0-9.0。 

更优选地，所述培养基的原料按重量分数计，含有1%果糖，1%酵母粉，4×10^-4mol/L Mg²⁺，pH 8.0。 

其次，本发明还提供了一种扁座壳孢发酵生产蛋白酶的方法，所述方法包含以下步骤： 

（a）将扁座壳孢接种种子培养基，制得发酵种子液；

（b）将步骤（a）中制得的发酵种子液按接种于所述的培养基，250mL的三角瓶装液量为150mL，接种量8mL，于26℃，转速160 r/min下培养。

所述种子培养基的原料含有：按培养基重量计算，20%土豆汁1L，葡萄糖20g，自然pH。 

本发明采用的座壳孢为扁座壳孢(何学友等，油茶黑胶粉虱及扁座壳孢对其自然控制作用，中国森林病虫，2011年7月)。 

采用本发明优化后的培养基，菌龄5d，发酵周期10d，发酵产生结果扁座壳孢产蛋白酶为80U/mL以上。 

本发明的有益效果：本发明的发酵方法有发酵周期短；条件温和，易于控制；提供的用于扁座壳孢发酵生产蛋白酶的培养基，具有蛋白酶产率高，蛋白酶活力高等优点。 

附图说明

图1 不同浓度的酪氨酸标准溶液标准曲线。 

图2 不同碳源对产蛋白酶的影响。 

图3 不同氮源对产蛋白酶的影响。 

图4 不同金属离子对产蛋白酶的影响。 

图5 不同维生素对产蛋白酶的影响。 

图6 不同初始pH对产蛋白酶的影响。 

图7 不同培养时间对产蛋白酶的影响。 

具体实施方式

本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。 

实施例1 

单因素实验确定培养基最优成分

（1）种子培养基和基础培养基配制

（a）20%土豆汁1L，葡萄糖20g，自然pH。分装于250mL的三角瓶，每个三角瓶含150mL。1.01MPa，灭菌20min。使用前可加入抗生素对培养基预处理。