本发明属于新琼二糖生产领域，具体涉及一种新琼二糖的生产方法，该方法包括将琼胶水溶液在β‑琼胶酶的存在下酶解为低聚新琼寡糖液，所述β‑琼胶酶的基因序列为SEQ ID NO:1；往低聚新琼寡糖液中加入硫酸进行酸解反应，再往所得酸解产物中加入碳酸钡充分搅拌沉淀，之后将体系中的沉淀通过固液分离去除，所得上清液干燥后得到新琼二糖干粉。本发明提供的方法所得产物中新琼二糖的占比较高。
本发明公开了一种组合利用内切型和外切型琼胶酶降解琼脂或或粗琼胶(红藻多糖提取物)获得高纯度新琼二糖的方法。本发明涉及一种琼胶酶AgaA和一种双功能酶AgaB，其中AgaA为内切型琼胶酶，能够迅速降解琼脂或琼脂糖产生新琼二糖、四糖和六糖，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；AgaB为双功能外切型琼胶酶，同时具有降解琼脂糖和紫菜多糖(即硫酸酯化的琼脂糖)的活性，能够降解琼脂或粗琼胶(红藻多糖提取物)或其寡糖产生单一产物新琼二糖，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。同时本发明还公开了利用基因工程技术重组表达和制备琼胶酶的方法。本发明所涉及的制备高纯度新琼二糖的方法及特异性琼胶酶(或紫菜多糖酶)，在制备琼胶寡糖领域有着广阔的应用前景。
本发明提供一种产3,6‑内醚‑L‑半乳糖的固定化酶，是将α‑新琼二糖水解酶和能将琼脂糖降解为新琼四糖的蛋白酶固定于固定化酶载体上而制备的，所述的α‑新琼二糖水解酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1或SEQ本发明所提供的固定化酶用于降解琼脂糖来制备3,6‑内醚‑L‑半乳糖或琼三糖。本发明解决了游离酶在工业化应用中存在的一些问题，制备了热稳定性更好、操作稳定性更高的固定化酶，提高了L‑AHG和琼三糖的产率，降低了琼胶寡糖的生产成本。实现了β‑琼胶酶和α‑新琼二糖水解酶两种不同琼胶酶的双酶共固定化，实现了在同一反应器中一步法快速、简便制备L‑AHG和琼三糖，为工业化制备L‑AHG和琼三糖奠定了基础。
本发明的目的在于提供一种β-琼胶酶及其应用，即一种能够降解琼脂糖产生单一的新琼2糖的β-琼胶酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。本发明的β-琼胶酶能够降解琼脂糖产生单一的新琼2糖，因此可以用于纯的新琼2糖的制备。本发明的大肠杆菌重组株，pETC/BL21所表达的重组琼胶酶占总蛋白的30%，表达水平高，易于纯化，且连续传代后表达量未有所降低。所以可以通过本发明大量制备重组β-琼胶酶和新琼2糖。
本发明涉及一种β-琼胶酶及重组表达菌株，所提供的β-琼胶酶的重组菌株能够高效的表达氨基酸序列为SEQ ID NO:1的β-琼胶酶，表达出的β-琼胶酶具有耐高温的特性。本发明的重组菌株能搞高效的表达β-琼胶酶，表达的β-琼胶酶具有耐高温的特性，能够特异性地降解琼胶产生聚合度为4-10的新琼寡糖，终产物为新琼四糖和新琼六糖，具有很好工业应用前景。
