[发明专利]用于大肠杆菌药物流出系统acr的检测试剂盒、检测方法及应用

摘要

本发明涉及微生物耐药性技术领域，具体公开一种用于大肠杆菌药物流出系统acr的检测试剂盒、检测方法及应用。本发明设计了acr耐药通路的4个基因的引物，并且以16S rDNA为内参基因。使用Fast Start Universal SYBR Green Master(Roche Diagnostics GmbH,Germany)抗性基因检测试剂盒检测基因的表达量，使用高通量荧光定量PCR仪进行扩增，两株细菌的氟喹诺酮相关基因的相对表达量和细菌之间的差异表达倍数可以直观地反应出来，更加科学和严谨，填补技术空白。 1

主权项

1.一种用于大肠杆菌药物流出系统acr的检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒用于高通量荧光定量PCR检测大肠杆菌药物流出系统acr，所述检测试剂盒包括16S rDNA为内参基因的acrF、acrR、acrE、acrS基因的引物，所述引物的序列如下：

16S的上游引物：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；

16S的下游引物：GGTTACCTTGTTACGACTT；

acrF的上游引物：GCGGCCAGGCACAAAA；

acrF的下游引物：TACGCTCTTCCCACGGTTTC；

acrR的上游引物：GCGCTGGAGACACGACAAC；

acrR的下游引物：GCCTTGCTGCGAGAACAAA；

acrE的上游引物：AAATACATCAGCCAGCAGGAG；

acrE的下游引物：GTTCAGTCGTTTGCCCATTAG；

acrS的上游引物：AAAAGAACCAAAGCCGAAGC；

acrS的下游引物：CGAAGTGCCAGTAGATAGCG。

2.一种用于大肠杆菌药物流出系统acr的检测方法，其特征在于：所述检测方法为高通量荧光定量PCR方法，所述检测方法至少包括以下步骤：

步骤1、从待测样品中提取DNA样品；

步骤2、采取权利要求1所述大肠杆菌药物流出系统acr的检测试剂盒对步骤1所提取的所述DNA样品使用高通量荧光定量PCR仪进行扩增反应；

步骤3、对所得结果进行数据分析。

3.如权利要求2所述的用于大肠杆菌药物流出系统acr的检测方法，其特征在于：所述高通量荧光定量PCR反应体系组成如下：Roche FastStart Universal SYBR Green Master：5μL，ddH₂O：3μL，上游引物：0.75μL，下游引物：0.75μL，DNA样品：0.5μL。

4.如权利要求3所述的用于大肠杆菌药物流出系统acr的检测方法，其特征在于：所述DNA样品的浓度为5ng/uL，所述上游引物和下游引物的浓度均为0.1μM。

5.如权利要求2所述的用于大肠杆菌药物流出系统acr的检测方法，其特征在于：所述步骤2中扩增反应的条件为：首先在95℃条件下反应10min，进行1次循环；其次在95℃条件下反应30s，进行40次循环，最后在60℃条件下反应30s，进行40次循环。

6.如权利要求2所述的用于大肠杆菌药物流出系统acr的检测方法，其特征在于：所述步骤3中采取数据的平均值、标准偏差、倍数变化值、热图进行分析。

7.如权利要求1所述的用于大肠杆菌药物流出系统acr的检测试剂盒或权利要求2‑6任一项所述的用于大肠杆菌药物流出系统acr的检测方法在大肠杆菌药物流出系统acr领域中的应用。