[发明专利]一种在大肠杆菌中制备线性单链DNA的方法有效
| 申请号： | 201610464596.X | 申请日： | 2016-06-23 |
| 公开（公告）号： | CN106119269B | 公开（公告）日： | 2019-12-06 |
| 发明（设计）人： | 张平静;冯文建;杨扬;王晋康;朱远源 | 申请（专利权）人： | 百奥迈科生物技术有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/70 | 分类号： | C12N15/70;C12N15/113;C12N15/10 |
| 代理公司： | 31280 上海申浩律师事务所 | 代理人： | 贾师英<国际申请>=<国际公布>=<进入 |
| 地址： | 226016 江苏省*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种用于制备线性单链DNA的方法，其包括：构建可表达Cas切口酶的Cas表达元件，整合入质粒；构建可在大肠杆菌细胞中与上述Cas表达元件兼容的sgRNA基因转录表达元件，并构建成质粒，得到sgRNA表达质粒；将Cas切口酶表达质粒和sgRNA表达质粒共同转化到大肠杆菌感受态细胞中；培养大肠杆菌至对数生长期，诱导Cas切口酶基因表达和自杀性sgRNA表达，Cas切口酶协同sgRNA自剪切sgRNA表达质粒的双链DNA并形成单链断裂，产生线性单链DNA；提取线性单链DNA。 | ||
| 搜索关键词： | 一种 大肠杆菌 制备 线性 dna 方法 | ||
【主权项】：
1.一种在大肠杆菌中制备线性单链DNA的方法，包括如下步骤：/nA)构建可表达Cas切口酶的Cas表达元件，该Cas表达元件包含操纵子、启动子、Cas切口酶基因序列、终止子、复制子和筛选标记基因，所述Cas切口酶是来源于化脓链球菌的spCas9或来源于金黄色葡萄球菌的saCas9；/nB)将步骤A)中得到的Cas表达元件整合入质粒或基因组，得到Cas切口酶表达质粒；/nC)构建可在大肠杆菌细胞中与上述Cas表达元件兼容的sgRNA基因转录表达元件，其包含操纵子、启动子、sgRNA基因序列、终止子、复制子和筛选标记基因，/nD)将步骤C)中得到的sgRNA基因转录表达元件构建成质粒，得到sgRNA表达质粒，该质粒上包含作为自杀sgRNA靶点的PAM序列和对应于所述线性单链DNA的序列；/nE)将步骤D)中得到的sgRNA表达质粒和步骤B)中得到的Cas切口酶表达质粒共同转化到大肠杆菌感受态细胞中；/nF)培养大肠杆菌至对数生长期，诱导Cas切口酶基因表达和自杀性sgRNA转录表达，Cas切口酶协同sgRNA自剪切sgRNA表达质粒的双链DNA并形成单链断裂，通过质粒的θ复制机制协同作用产生线性单链DNA；/nG)提取sgRNA基因转录表达元件自剪切的DNA产物中的线性单链DNA。/n
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- 吴辉;赖宁玉;赵舒欣;王文卓;黎冠忠 - 华东理工大学
- 2019-09-27 - 2019-12-13 - C12N15/70
- 本发明提供一种利用乙酸或其盐生产3‑羟基丙酸的代谢工程大肠杆菌菌株的构建方法，在利用乙酸或其盐经乙酰‑CoA羧化酶和丙二酰‑CoA还原酶生产3‑HP代谢途径的基础上进一步改造，包括以下两种途径中的一种或两种：(1)抑制脂肪酸合成并促进乙醛酸循环以增加流向目标代谢产物的乙酰‑CoA和丙二酰‑CoA代谢流并增强能量代谢；(2)抑制脂肪酸合成途径以增加流向目标代谢产物的乙酰‑CoA和丙二酰‑CoA代谢流。本发明通过在已构建的外源表达3‑HP途径基础上，对代谢途径和调控的分析，利用基因工程手段对大肠杆菌进行改造，获得的菌株在以乙酸或其盐为碳源的培养基中生产3‑HP，得率可达0.38g/g，为最大理论产量的50.7％。
- 制备无融合标签包涵体蛋白纳米颗粒的方法-201610529226.X
- 熊思东;齐兴梅 - 苏州大学
- 2016-07-07 - 2019-12-13 - C12N15/70
- 本发明涉及一种制备无融合标签包涵体蛋白纳米颗粒的方法，包括以下步骤：将自发断裂蛋白质内含子的C端与目的蛋白基因融合，N端与增强目的蛋白表达的标签蛋白融合，得到融合蛋白编码基因；将融合蛋白编码基因在大肠杆菌中诱导表达，通过自发断裂蛋白质内含子的C端自发断裂，释放所述目的蛋白，形成包涵体蛋白；将大肠杆菌细胞破碎，离心，弃掉上清液，得到无融合标签包涵体蛋白纳米颗粒。本发明解决了在包涵体蛋白颗粒水平上实现标签蛋白的移除，填补了制备无标签包涵体蛋白纳米颗粒的技术空白，并且蛋白质内含子的自发断裂在大肠杆菌体内完成，后处理简单。
- 一种延缓皮肤衰老基因工程核酸因子膏的制备方法及使用方法-201910846754.1
- 王秀芳;闫丽芳;吕白雪;吉宁;苏利波;刘树锋;宋志学;吕占军 - 河北医科大学
- 2019-09-09 - 2019-12-10 - C12N15/70
- 本发明提供了一种延缓皮肤衰老基因工程核酸因子膏及使用方法；方法包括如下步骤：步骤一，无内毒素污染的基因工程小分子RNA制备：将表达人小RNA的DNA序列插入pET‑28α质粒中构建表达载体，将表达载体转化BL‑21菌，用IPTG诱导使转化的BL‑21菌产生人小RNA，用SDS‑NaCl提取无内毒素污染的人小RNA；步骤二，制备延缓皮肤衰老基因工程核酸因子膏：将制备的RNA进行干燥处理，与基质混合，加入透皮吸收剂，即制成了延缓皮肤衰老基因工程核酸因子膏。本发明从皮肤衰老的本质入手，用人小RNA调节皮肤细胞的基因表达，达到延缓皮肤衰老的目的，疗效明显，作用持久。
- 一种微生物生产丙酸的方法-201610227348.3
- 刘天罡;柳志杰;王艺璇;邓子新 - 武汉大学
- 2014-01-24 - 2019-12-10 - C12N15/70
- 本发明公开了一种微生物生产丙酸的方法，属于可再生能源和生物质能源以及化工原料生产领域。该方法是在微生物体内引入外源基因——丙二酰辅酶A还原酶基因、丙二酸半醛还原酶基因、3‑羟基丙酰辅酶A合成酶基因、3‑羟基丙酰辅酶A脱水酶基因和丙烯酰辅酶A还原酶基因，从而催化自身的丙二酰辅酶A得到丙酸；所述的微生物为大肠杆菌。本发明实现了改造微生物直接利用二氧化碳合成丙酸，不需利用石油资源来进行化学合成，减少了对石油的消耗和环境的污染，是一种可再生的、低消耗、环保的技术，可缓解当前的温室效应。本发明通过微生物固定二氧化碳生产丙酸可直接应用于工业生产。
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