[发明专利]一种利用荧光检测微囊藻细胞DNA损伤的方法

摘要

本发明公开一种利用荧光检测微囊藻细胞DNA损伤的方法，其步骤：（a）将待检测样品和对照样品均分别平均分成三小组；（b）去除细胞角质鞘：离心收集样品中藻细胞并重悬浮于SE缓冲液中洗涤；（c）细胞裂解：将细胞分别重悬浮于Lysis裂解液，加入蛋白酶K和十二烷基磺酸钠，使细胞裂解；（d）细胞DNA链解旋：改变pH，使T、P和B样品在不同条件下解旋；（e）染色：分别向以上T、P和B样品中加入Hoechest 33258染色；（f）荧光测定：离心后于荧光检测器中检测上清液的荧光强度；（g）结果计算：根据待测样品和对照样品中T、B和P样品的荧光来计算DNA链的断裂水平。本方法易于掌握，并且灵敏度高，DNA链上单个断裂位点即可检测到。

主权项

1.一种利用荧光检测微囊藻细胞DNA损伤的方法，其步骤是：(a)分组设定：除待检测样品外设置正常生长的样品为对照组，待检测样品标记为t，对照样品标记为0，将待检测样品和对照样品分别平均分成三组，测试样品标记为P_t样品、T_t样品和B_t样品；对照样品分别标记为P₀样品、T₀样品和B₀样品，在以下步骤(b)至(f)中，对测试样品和对照样品处理方式相同，在以下步骤(b)至(f)的表述中，T样品包含T_t样品和T₀样品，P样品包含P_t样品和P₀样品，B样品包含B_t样品和B₀样品；(b)去除细胞角质鞘：1500×g离心15min收集T、P和B样品中藻细胞，将细胞重悬浮于1mL SE缓冲液：SE缓冲液的配制方法：50mM NaCl，50mM Tris，5mM EDTA，调pH至8.0颠倒混匀洗涤2～5min；(c)细胞裂解：1500×g离心15min，去上清液，将细胞分别重悬浮于415V体积的Lysis裂解液：Lysis裂解液的配制方法：40mM EDTA，400mM NaCl，50mM Tris‑HCl，pH＝9.0，分别加入50V体积的浓度为50mg/ml溶菌酶，上下颠倒样品管三次，37℃反应20min；然后加入10V体积浓度为5mg/ml的蛋白酶K和25V体积浓度为10％的十二烷基磺酸钠，上下颠倒样品管三次，50℃反应2h；(d)细胞DNA链解旋：T样品加入1000V体积的超纯水，混匀；B样品加入500V体积的0.1M NaOH混匀，超声处理180s，20℃温浴30min，随后加入500V体积的0.1M HCl，混匀；P样品，加入500V体积的0.1M NaOH混匀，20℃温浴30min，随后加入500V体积的0.1M HCl，混匀；(e)染色：分别向以上T、P和B样品中加入100V体积的60μM Hoechest33258：溶解于0.1M磷酸缓冲液中，pH＝7.6，混匀，25～30℃下10000rpm离心5min，整个过程避光；(f)荧光测定：根据不同检测器分别取对应量T、P和B样品上清液，于荧光检测器中测荧光强度，T、P和B样品的荧光强度分别记为f_P、f_B和f_T；(g)结果计算：DNA链断裂指数SSF的计算：首先，计算残留双链DNA百分比F，F＝(f_P－f_B)/(f_T－f_B)×100％然后，根据所计算出的F值计算DNA链断裂指数，计算公式为SSF＝‑ln(F_t/F₀)其中，F₀为对照组的F值，由对照组的P₀样品、T₀样品和B₀样品的荧光强度f计算得到；F_t为处理组的F值，由处理组P_t样品、T_t样品和B_t样品的荧光计算强度f得到。