[发明专利]一种利用荧光检测微囊藻细胞DNA损伤的方法

说明书

本发明公开一种利用荧光检测微囊藻细胞DNA损伤的方法，其步骤：（a）将待检测样品和对照样品均分别平均分成三小组；（b）去除细胞角质鞘：离心收集样品中藻细胞并重悬浮于SE缓冲液中洗涤；（c）细胞裂解：将细胞分别重悬浮于Lysis裂解液，加入蛋白酶K和十二烷基磺酸钠，使细胞裂解；（d）细胞DNA链解旋：改变pH，使T、P和B样品在不同条件下解旋；（e）染色：分别向以上T、P和B样品中加入Hoechest 33258染色；（f）荧光测定：离心后于荧光检测器中检测上清液的荧光强度；（g）结果计算：根据待测样品和对照样品中T、B和P样品的荧光来计算DNA链的断裂水平。本方法易于掌握，并且灵敏度高，DNA链上单个断裂位点即可检测到。

技术领域

本发明涉及环境检测与生态毒理评价技术领域，更具体涉及一种微囊藻细胞DNA损伤检测的方法，它适用于水体中有毒有害物质的生态安全评价及水环境中致癌致畸因子的早期监测预警。

背景技术

随着水体富营养化的加剧，蓝藻水华现象时常发生。蓝藻水华造成水质急剧恶化，鱼类大量死亡，生境退化。微囊藻作为水华的主要藻种之一，不仅增殖能力强，而且产生微囊藻毒素，导致家畜死亡，也可能引发人类肝脏癌变。DNA作为中心法则的核心，对细胞的分裂、代谢与调控起着决定性作用，DNA损伤作为一个灵敏而有代表性的生物标志物，广泛应用于生态毒理与安全评价中。针对不同控藻方法的微囊藻DNA损伤评估，不仅有助于蓝藻水华控制技术的开发；同时，微囊藻对环境中致癌致畸因子响应灵敏，通过对微囊藻DNA损伤的检测，可实现对水体环境中致癌致畸因子的早期监测预警。

目前还没有专门针对微囊藻细胞DNA损伤检测的方法。Singh等(“A simpletechnique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells”.Singh et al.,Experimental Cell Research,卷:175期:1页:184-191,1988年3月15日)在前人方法的基础上，提出了单细胞凝胶电泳法测定细胞DNA损伤。该方法简便，灵敏，在医学和毒理学检测研究中有较多的应用。然而，该方法只能检测单链DNA损伤，并且操作主观性强，不同操作者实验结果偏差较大，因而限制了这一方法的广泛应用。最近，有一些学者提出了利用PCR扩增的方式来检测DNA链断裂的方法，如RAPD、rDNA和ARDRA(“Evidencesshowing ultraviolet-B radiation-induced damage of DNA in cyanobacteria andits detection by PCR assay”.Kumar.,et al,Biochemical and Biophysical ResearchCommunications,卷:318期：4页:1025-1030,2004年6月11日)，以及通过实时荧光定量PCR(“DNA supercoiling suppresses real-time PCR:a new approach to thequantification of mitochondrial DNA damage and repair”.Chen et al.,NucleicAcids Research,卷:35期:4页:1377-1388,2007年2月11日)的办法来定量DNA损伤的程度，这些方法在特定细胞DNA链断裂检测中显示了很高的特异性，但应用藻类DNA损伤中还有待进一步实验证实，并且该方法操作难度大，需要大型仪器如荧光定量PCR仪，测试费用高，难以普遍应用于环境检测。本方法是根据不同断裂水平的DNA链在碱性溶液中解旋速率不同，通过荧光染色对解旋后DNA链中双链部分进行定量来测定细胞DNA损伤。其原理为：DNA链断裂后，自由末端增多，双链DNA在适宜的碱性pH值下氢键断裂，双链DNA解链，自由末端越多，解旋速率越快。双链DNA荧光染料Hoechst 33258能选择性的与双链DNA结合，而不与单链DNA结合，由此可以计算DNA单双链的比例，通过比较相同解旋时间后DNA单双链的比例，来计算DNA链断裂的水平。本方法不会受到染色体结构的影响，并且灵敏度高，可以检测到染色体上的单个断裂位点，因此非常适合测定浮游生物DNA链断裂。

发明内容