[发明专利]一种通过检测胚芽鞘内病毒增殖速度快速评价小麦丛矮病品种抗性的方法

摘要

本发明公开了一种通过检测胚芽鞘内病毒增殖速度快速评价小麦丛矮病品种抗性的方法，该方法步骤如下：1）选择鉴定标尺；2）低氧诱导待测小麦和鉴定标尺品种的胚芽鞘；3）胚芽鞘接种带毒灰飞虱后暗培养；4）荧光定量PCR获得各小麦品种周期时间点的RBSDV病毒S7与内参基因的相对表达量（RQ值）；5）绘制RBSDV增殖指数趋势线；6）根据RBSDV增殖指数趋势线公式评价待测小麦品种对小麦丛矮病的抗性水平和抗性等级。本发明通过检测胚芽鞘内病毒增殖速度快速评价小麦丛矮病品种抗性，能够从分子水平上快速确定小麦品种对小麦丛矮病的抗性水平和抗性等级，鉴定周期短且可靠性高，具有较大的育种应用价值。

主权项

1.一种通过检测胚芽鞘内病毒增殖速度快速评价小麦丛矮病品种抗性的方法，其特征在于：该鉴定方法包括以下步骤：1）选择鉴定标尺：根据人工接毒鉴定中不同品种对小麦丛矮病表现设置高抗、中抗、感病三个鉴定标尺，选择三个相应小麦品种做为鉴定标尺；2）低氧诱导待测小麦和鉴定标尺品种的胚芽鞘：每个品种取 15‑20 粒种子，用 0.6% 次氯酸钠溶液浸泡15min进行灭菌，超纯水冲洗干净，然后放置于25℃条件下适宜浓度的IAA溶液中低氧诱导培养 3 天，诱导出胚芽鞘；3）胚芽鞘接种带毒灰飞虱后暗培养：将胚芽鞘用超纯水洗净，放入铺有吸水棉的试管中，每个试管一个种子，定量接种带毒灰飞虱，用透气纱布封闭试管后平置，传毒 24h，将传毒后胚芽鞘用超纯水冲洗，然后放置于 25℃条件下浸润了适宜浓度的 ABA 溶液的吸水棉上暗培养；4）荧光定量 PCR 获得各小麦品种周期时间点的 RBSDV 病毒 S7 与内参基因的相对表达量RQ 值：按照周期时间点采集待测小麦和鉴定标尺特定位置的胚芽鞘 40‑60g，每个品种每个取材时间点取材 2‑3 重复，‑70℃保存，提取 RNA 并纯化，取 1μL 上述病毒 RNA 提取液，加入荧光定量 PCR 反应体系，利用引物 RBSDV‑F：5’‑AGA GCT CTT CTA GTT ATT GCG‑3’和RBSDV‑R：5’‑TCA GCA AAA GGT AAA GGA ACG‑3’按照荧光定量 PCR 扩增程序扩增 RBSDV 病毒S7片段，扩增完毕，进入结果分析界面，以GAPDH为内参，与对照组相比，获得每个品种每个取样时间点重复的 RBSDV 病毒 S7 与内参基因的相对表达量RQ 值；5）绘制RBSDV增殖指数趋势线：利用多重复的RQ值统计每个待测品种和鉴定标尺饲毒后每个取样时间点的 RQ 值均值，以 RQ 值均值为纵坐标、饲毒后周期取样时间点为横坐标，对数据进行统计分析，获得 RBSDV 增殖指数趋势线 y=Ae^kx；6）根据 RBSDV 增殖指数趋势线公式评价待测小麦品种对小麦丛矮病的抗性水平和抗性等级：根据每个品种RBSDV增殖指数趋势线公式y=Ae^kx 评价待测小麦品种的抗性水平，即公式中 k 值大的品种比 k 值小的品种对 RBSDV 抗性低，待测品种 k 值小于等于高抗标尺的为高抗品种，待测品种k值大于高抗标尺且小于等于中抗标尺的为中抗品种，待测品种k值大于中抗标尺且小于等于感病标尺的为感病品种，待测品种 k 值大于感病标尺的为超感品种；步骤 1）中的高抗鉴定标尺为室内接毒鉴定中抗病表现在当地小麦品种资源中排名为 9%‑11%；中抗鉴定标尺排名为 23%‑27%；感病鉴定标尺排名为 47%‑53%；步骤 2）中的适宜浓度的 IAA 溶液浓度为 1.5‑2.5μmol/L；所述的低氧诱导方法为种子置于液面下 5‑10cm 处培养；步骤 3）中的带毒灰飞虱的获取步骤为：3.1）RBSDV 毒源获取：从小麦丛矮病重病区田间采集表现为小麦丛矮病症状的小麦幼嫩病株，‑70℃保存；3.2）传毒介体继代繁殖：大田采集并纯化灰飞虱高龄若虫，用小麦幼苗饲养并传代；3.3）介体饲毒：饲毒时从‑70℃冰箱中取出小麦丛矮病病株，常温放置 3‑5h 使病株自然展开，然后用吸水棉布包裹病株根部后用塑料袋紧密包扎，确保水不会流出，然后将其移入保鲜盒内，将室内人工饲养的灰飞虱转入保鲜盒内的RBSDV毒源小麦上，25℃饲毒48h后移除毒源，将灰飞虱转移到小麦幼苗上饲养度过循回期即为带毒灰飞虱；步骤 3）中的适宜浓度的 ABA 溶液浓度控制为 40‑60μmol/L；所述步骤 3）中的定量接种带毒灰飞虱控制为 6‑10 虫/个胚芽鞘；步骤 4）中的周期取样时间点为 RBSDV 传毒后 4‑10 天内每隔1.5‑2.0 天均匀分布的 3‑4 个时间点；特定位置的胚芽鞘为胚芽鞘长度的正中间部位；步骤4）中的提取RNA的方法为：取适量胚芽鞘加液氮于研钵中迅速磨碎，按比例加入 TRI‑Reagent 到 1.5ml 离心管中，样品体积不超过 TRI‑Reagent 体积 10%，4℃ 12000×g 低温离心 1.5min，然后小心转移上清到新的离心管中；步骤 4）中实时荧光定量 PCR 扩增程序为：95℃预变性 2min；95℃变性 15s，60℃退火 15s，72℃延伸 20s，共进行 40 次循环；95℃变性 15s，60℃退火 1min，95℃变性 15s；步骤 3.3）中的 RBSDV 毒源小麦来源于步骤 3.1）中的表现为小麦丛矮病症状的小麦幼嫩病株。