[发明专利]造血祖细胞的制备方法及其专用培养基

摘要

本发明提供一种造血祖细胞的制备方法及其专用培养基，所述专用培养基由分化培养基I-1或分化培养基I-2，分化培养基II-1或分化培养基II-2和分化培养基III-1或分化培养基III-2组成；所述分化培养基I-2为在第一阶段分化培养基中添加人BMP4和人Wnt3a得到的培养基；所述分化培养基II-2为在第二阶段分化培养基中添加人血管内皮细胞生长因子和人碱性成纤维细胞生长因子得到的培养基；所述分化培养基III-1为第三阶段分化培养基；所述分化培养基III-2为在第三阶段分化培养基中添加全反式视黄酸(RA)得到的培养基；本发明提供的方法产生的造血祖细胞适合作为人原代造血祖细胞的替代品。

主权项

诱导人胚胎干细胞分化为造血祖细胞的培养基，由分化培养基I，分化培养基II和分化培养基III组成；分化培养基I为分化培养基I‑1或分化培养基I‑2；分化培养基II为分化培养基II‑1或分化培养基II‑2；分化培养基III为分化培养基III‑1或分化培养基III‑2；所述分化培养基I‑1为在第一阶段分化培养基中添加骨形态发生原蛋白‑4得到的培养基；所述分化培养基I‑1中的所述骨形态发生原蛋白‑4终浓度为10‑100ng/ml；所述分化培养基I‑2为在第一阶段分化培养基中添加骨形态发生原蛋白‑4和Wnt3a得到的培养基；所述分化培养基I‑2中的所述骨形态发生原蛋白‑4的终浓度为10‑100ng/ml，所述Wnt3a的终浓度为50‑150ng/ml；所述分化培养基II‑1为在第二阶段分化培养基中添加血管内皮细胞生长因子得到的培养基；所述分化培养基II‑1中的所述血管内皮细胞生长因子的终浓度为50‑150ng/ml；所述分化培养基II‑2为在第二阶段分化培养基中添加血管内皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子得到的培养基；所述分化培养基II‑2中的所述血管内皮细胞生长因子的终浓度为50‑150ng/ml，所述碱性成纤维细胞生长因子的终浓度为50‑150ng/ml；所述分化培养基III‑1为第三阶段分化培养基；所述分化培养基III‑2为在第三阶段分化培养基中添加全反式视黄酸得到的培养基，所述分化培养基III‑2中的所述全反式视黄酸的终浓度为1‑5μM；所述第一阶段分化培养基为在用于培养哺乳动物细胞的基础细胞培养基上添加牛血清白蛋白得到的培养基；所述第一阶段分化培养基中的所述牛血清白蛋白的终浓度为0.1‑1mg/ml；所述第二阶段分化培养基为在所述第一阶段分化培养基上添加胰岛素‑转铁蛋白‑硒盐、维生素C酸和硫代甘油得到的培养基；所述第二阶段分化培养基中的所述胰岛素‑转铁蛋白‑硒盐的终浓度为0.5‑1.5％(体积百分含量)，所述维生素C酸的终浓度为0.1‑1mmol/l，所述硫代甘油的终浓度为0.1‑1mmol/l；所述第三阶段分化培养基为将所述第二阶段分化培养基中的胰岛素‑转铁蛋白‑硒盐替换成B27得到的培养基，所述第三阶段分化培养基中的所述B27的终浓度为0.5‑1.5％(体积百分含量)。