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[发明专利]用于预防和治疗脑血栓后遗症的药物组分及其制备方法和应用-CN202310902860.3在审
发明人： 陈继冰;王雪莹 -专利权人：广州四叶草健康科技有限公司
申请日： 2023-07-21 - 公布日： 2023-10-13 - 主分类号： A61K31/7105 文献下载
摘要：本申请涉及外泌体制备的技术领域，具体公开了一种用于预防和治疗脑血栓后遗症的药物组分及其制备方法和应用。所述药物组分包括Exo‑miR‑17‑92和Exo‑miR‑30d‑5p；是以能够同时过表达基因miR‑17‑92和基因miR‑30d‑5p的间充质干细胞分泌得到；所述基因miR‑17‑92的序列如SEQ ID NO:1所示，所述基因miR‑30d‑5p的序列如SEQ ID NO:2所示。本申请的药物组分包括Exo‑miR‑17‑92和Exo‑miR‑30d‑5p，通过二者表达产物的协同作用发挥显著优异的脑血栓后遗症的治疗效果。
用于预防治疗脑血栓后遗症药物组分及其制备方法应用

[发明专利]用于改善色素沉着的基因修饰外泌体及其制备方法与应用-CN202310902863.7在审
发明人： 陈继冰;王雪莹 -专利权人：广州四叶草健康科技有限公司
申请日： 2023-07-21 - 公布日： 2023-09-08 - 主分类号： C12N5/10 文献下载
摘要：本发明涉及外泌体生物技术领域，尤其是涉及一种用于改善色素沉着的基因修饰外泌体及其制备方法与应用；一种用于改善色素沉着的基因修饰外泌体，基因修饰外泌体为过表达miR‑330‑5p基因修饰的间充质干细胞外泌体，基因修饰外泌体的制备方法包括以下步骤：构建miR‑330‑5p基因的过表达载体；将miR‑330‑5p基因的过表达载体转染293T细胞，进行慢病毒包装，收集上清；将收集的上清转染间充质干细胞；筛选转染阳性的间充质干细胞，并扩大培养，收集上清，提取得到过表达miR‑330‑5p基因修饰的间充质干细胞外泌体；本申请中采用慢病毒转染MSC，细胞核内的miR‑330‑5p基因可随MSC的扩增长期存在，形成稳定的工业化大量生产。
用于改善色素沉着基因修饰外泌体及其制备方法应用

[发明专利]一种人体皮肤成纤维细胞外泌体制备分离方法-CN202110176419.2有效
发明人：王雪莹;陈继冰 -专利权人：广州四叶草健康科技有限公司
申请日： 2021-02-07 - 公布日： 2023-08-18 - 主分类号： C12N5/071 文献下载
摘要：本申请涉及外泌体分离领域，更具体地说，它涉及一种人体皮肤成纤维细胞外泌体制备分离方法，具体包括如下步骤：S1、对人体皮肤成纤维细胞进行扩增培养；S2、换用无血清培养基，对扩增后的人体皮肤成纤维细胞进行饥饿培养，饥饿培养过程中切换至无氧状态，并通入少量一氧化氮对人体皮肤成纤维细胞进行刺激；S3、取上清液，并通过滤膜过滤除去细胞和细胞碎片；S4、通过超速离心法，分离上清液中的外泌体。在本申请中，通过一氧化氮刺激人体皮肤成纤维细胞，使之可以更好地分泌外泌体，进而提高了外泌体的产量。
一种人体皮肤纤维细胞体制分离方法

[发明专利]一种用于胰岛皮下移植的胰岛存活基质及其制备方法、可皮下移植的胰岛-CN202310444717.4在审
发明人： 陈继冰;王雪莹 -专利权人：广州四叶草健康科技有限公司
申请日： 2023-04-23 - 公布日： 2023-08-08 - 主分类号： C12N5/071 文献下载
摘要：本申请涉及胰岛移植的技术领域，具体公开了一种用于胰岛皮下移植的胰岛存活基质及其制备方法、可皮下移植的胰岛。胰岛存活基质包括以下组分：培养液80‑110ml/l，L‑谷氨酰胺200‑260mg/l，胰岛素样生长因子‑1 2‑8mg/l，血管内皮生长因子2‑8mg/l，保护剂8‑15mg/l，胶原蛋白2000‑3000mg/l，pH缓冲剂1.2‑2.5mg/l，整合素亚基1‑3.5mg/l，整合素亚基是整合素α亚基和整合素β亚基的混合物；可皮下移植的胰岛包括上述胰岛存活基质。本申请的可皮下移植的胰岛在移植后具有存活寿命长、功能稳定发挥的优点。
一种用于胰岛皮下移植存活基质及其制备方法

[发明专利]一种神经干细胞外泌体鼻腔喷剂及其制备方法-CN202110437552.9有效
发明人： 陈继冰;王雪莹 -专利权人：广州四叶草健康科技有限公司
申请日： 2021-04-22 - 公布日： 2023-08-01 - 主分类号： A61K47/26 文献下载
摘要：本申请涉及外泌体制剂领域，具体涉及一种神经干细胞外泌体鼻腔喷剂及其制备方法，其中一种神经干细胞外泌体鼻腔喷剂包括缓冲溶液和悬浮于缓冲溶液中的如下组分：（1～100）×108个/mL的神经干细胞外泌体；占缓冲溶液质量分数为1.6～10%的渗透压调节剂；所述渗透压调节剂为甘露醇、蔗糖、山梨醇中的一种，或甘露醇、蔗糖、山梨醇中任意数种的复配体系。通过将神经干细胞外泌体和上述渗透压调节剂进行复配，既具有较好的保存效果，也具有较佳的吸收性能。
一种神经干细胞外泌体鼻腔及其制备方法

[发明专利]一种以脂肪间充质干细胞分化胰岛β细胞的方法以及胰岛β细胞-CN202310438556.8在审
发明人： 陈继冰;王雪莹 -专利权人：广州四叶草健康科技有限公司
申请日： 2023-04-23 - 公布日： 2023-07-28 - 主分类号： C12N5/071 文献下载
摘要：本申请涉及胰岛细胞分化的技术领域，具体公开了一种以脂肪间充质干细胞分化胰岛β细胞的方法以及胰岛β细胞。该方法包括步骤：A1、传代培养；A2、细胞分化：将人间充质干细胞在诱导分化培养液中培养5‑7天，随后加入补充添加物培养，得胰岛β细胞；诱导分化培养液包括以下组分：DMEM/F12培养液、N2补充物、B27补充物、维甲酸、角质细胞生长因子、5‑10ng/ml PDX1人重组蛋白和15‑25ng/ml NKX2.2人重组蛋白；补充添加物包括以下组分：肝细胞生长因子、烟酰胺、3‑异丁基‑1‑甲级黄嘌呤和表皮生长因子。本申请方法具有制备周期短的优点，本申请胰岛β细胞具有胰岛素和C‑肽分泌量高的优点。
一种脂肪间充质干细胞分化胰岛细胞方法以及

[发明专利]一种毛乳头细胞外泌体制备分离方法-CN202110168593.2有效
发明人：王雪莹;陈继冰 -专利权人：广州四叶草健康科技有限公司
申请日： 2021-02-07 - 公布日： 2022-12-06 - 主分类号： C12N5/071 文献下载
摘要：本申请涉及外泌体提取领域，更具体地说，它涉及一种毛乳头细胞外泌体制备分离方法，通过先对毛乳头细胞进行培养和初步分离后，通过PEG修饰壳聚糖偶联其中的外泌体，再通过蛋白酶对大分子蛋白进行消化，离心分离后再通过酶解法降解壳聚糖，最终得到外泌体。上述方案可以有效提高制备分离得到的外泌体的产量和纯度。
一种乳头细胞体制分离方法

[发明专利]一种人脐带间充质干细胞的分离和培养方法-CN201610910131.2有效
发明人： 陈继冰;吴振化 -专利权人：浙江译美生物科技有限公司
申请日： 2016-10-19 - 公布日： 2020-10-27 - 主分类号： C12N5/0775 文献下载
摘要：本发明公开了一种人脐带间充质干细胞的分离和培养方法，该分离和培养方法包括以下步骤：新生儿新鲜的离体脐带→低温PBS液保存、冲洗→低温浸泡液中剪切→低温PBS液冲洗，低温真空处理→解冻→加入PBS液浸润→加入第一混合酶溶液，振荡酶解处理→加入第二混合酶溶液，振荡酶解处理→加入胎牛血清、PBS液、LG‑DMEM培养基，静置后离心，弃上清→加入PBS液，静置后离心，弃上清→加入胎牛血清、PBS液、LG‑DMEM培养基，静置后离心，弃上清→加入胎牛血清、PBS液、LG‑DMEM培养基，混匀→扩增培养；具有提高脐带间充质干细胞纯度的效果。
一种脐带间充质干细胞分离培养方法

[发明专利]一种外周血NK细胞的体外诱导扩增培养方法-CN201610242598.4有效
发明人： 陈继冰;牛立志;徐克成 -专利权人：广州复大医疗有限公司
申请日： 2016-04-18 - 公布日： 2020-06-02 - 主分类号： C12N5/0783 文献下载
摘要：本发明提供了一种外周血NK细胞的诱导扩增培养方法。本发明所述的外周血NK细胞的诱导扩增培养方法是通过应用细胞因子白介素‑2、白介素‑15、4‑1BBL和SCGM培养基联合培养外周血单个核细胞，前期白介素‑15和4‑1BBL孵育固定在细胞培养板上诱导激活单个核细胞中的少量NK细胞快速增殖，后期溶解性的白介素‑15和4‑1BBL诱导NK细大量快速增殖，然后收集培养的NK细胞进行细胞纯度和对肿瘤细胞杀伤作用的检测以确保NK细胞的抗肿瘤作用。本发明方法诱导培养过程简单易行，周期较短，成本低廉；获得率高，重复性好；培养后细胞活力好，获得的NK细胞数量和活力均能保证临床肿瘤免疫治疗的应用。
一种外周血 nk 细胞体外诱导扩增培养方法

[发明专利]基于免疫磁珠和流式细胞仪的循环肿瘤细胞检测方法-CN201810600371.1在审
发明人： 陈继冰;王雪莹 -专利权人：广州四叶草健康科技有限公司
申请日： 2018-06-12 - 公布日： 2018-12-11 - 主分类号： G01N33/543 文献下载
摘要：本发明提供了一种基于免疫磁珠和流式细胞仪的循环肿瘤细胞检测方法，其包括以下步骤：对外周血进行穿刺抽血，然后将血液进行重悬血细胞，去掉大部分红细胞，再加入CD326磁珠进行分离；经过第一次流式细胞仪分选，去掉大部分淋巴细胞，再进行第二次流式细胞仪分选，去掉全部淋巴细胞，最后对剩余细胞进行第三次流式细胞仪分选，即检测出是否存在循环肿瘤细胞。本发明的方法简单易操作，检测灵敏度高。
循环肿瘤细胞流式细胞仪分选淋巴细胞流式细胞免疫磁珠检测红细胞检测灵敏度血细胞剩余细胞穿刺抽血磁珠重悬血液

[发明专利]一种分离并激活人外周血极小胚胎样干细胞的方法-CN201810441922.4在审
发明人： 陈继冰;王雪莹 -专利权人：广州四叶草健康科技有限公司
申请日： 2018-05-10 - 公布日： 2018-09-28 - 主分类号： C12N5/0735 文献下载
摘要：本发明公开了一种分离并激活人外周血极小胚胎样干细胞的方法，其包括以下步骤：S1、采集外周血，分离出血浆和细胞；S2、将步骤S1所得血浆放入超声清洗仪中进行破碎，得到血浆裂解物；S3、将步骤S1所得细胞进行重悬与清洗，并冷藏保存；S4、将部分步骤S2所得血浆裂解物装入第一血袋中，将剩余部分血浆裂解物与步骤S3所得细胞混合，过滤，得到极小胚胎样干细胞，再装入第一血袋中，得到激活的极小胚胎样干细胞，并排掉第一血袋中的气体后密封。本发明的步骤简单，操作方便，其分离得到的极小胚胎样干细胞纯度可达到91％，活性可达到85％。
干细胞血浆胚胎裂解物血袋人外周血激活细胞装入超声清洗仪冷藏保存外周血放入重悬密封过滤破碎清洗采集

[发明专利]一种纳米微粒胶体及其制备方法与用途-CN201510353276.2有效
发明人：朴相浩;梁淑贞;林茂;李媛;左建生;刘建国;徐克成;牛立志;李海波;穆峰;陈继冰 -专利权人：广州复大医疗股份有限公司
申请日： 2015-06-24 - 公布日： 2018-02-09 - 主分类号： A61K9/14 文献下载
摘要：本发明属医药制药技术领域，涉及一种肿瘤化疗药物的新剂型，特别是涉及一种纳米微粒胶体以及其制备方法和应用。本发明所述的纳米微粒胶体，它是由盐酸吉西他滨和复方甘草酸苷注射液混合形成的微粒平均直径为100nm的胶体。本发明为肿瘤介入治疗及其介入材料的制备提供了一种新的方法，本发明所述的纳米微粒胶体对肿瘤患者具有积极地治疗效果。本发明将已在临床应用并获得肯定疗效的两种药物混合制成新的纳米微粒胶体，具有操作简便、易于质控、获得纳米微粒率高的特点。
一种纳米微粒胶体及其制备方法用途

[发明专利]一种培养人脐带间充质干细胞的方法-CN201610910134.6在审
发明人： 陈继冰;吴振化 -专利权人：浙江译美生物科技有限公司
申请日： 2016-10-19 - 公布日： 2017-04-19 - 主分类号： C12N5/0775 文献下载
摘要：一种培养人脐带间充质干细胞的方法，包括以下步骤采集新鲜的人脐带，切除双侧带夹痕及淤血的部分，用含双抗的PBS缓冲液充分冲洗脐带外周以及脐静脉内腔；沿脐静脉内腔纵向剪开血管，剥离脐静脉内膜，将剩余组织切成小块，贴于预先用完全培养基A润湿的T25培养瓶底壁；将T25培养瓶，置于37 ℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度孵箱中，过夜后翻转；每24 h加入1mL上述完全培养基A，72 h全量换液，以后每周换液2次，观察贴块周围贴壁细胞爬出情况，2周后去贴块；当细胞达70%～80%融合时，以含1.25g/L胰蛋白酶和1g/L乙二胺四乙酸的消化液消化后，以(2.5～5.0)×103/cm2密度接种传代培养，计为第一代细胞。该种方法及能保证充质干细胞的活性又能提高培养效率。
一种培养脐带间充质干细胞方法

[发明专利]用于脂肪干细胞的冻存液及其制备方法以及培养基-CN201610938658.6在审
发明人： 陈继冰;吴振化 -专利权人：浙江译美生物科技有限公司
申请日： 2016-11-01 - 公布日： 2017-04-19 - 主分类号： A01N1/02 文献下载
摘要：本发明公开了一种用于脂肪干细胞的冻存液及其制备方法以及培养基。该培养基包括如下重量份数的组分：无机盐复合物 7200‑7300份；氨基酸复合物 980‑1000份；维生素复合物 40‑45份；葡萄糖1000‑1100份；丙酮酸钠 100‑110份；丁酸60‑75份；丁酸钠 80‑110份；柠檬酸铁 0.15‑0.22份；水 1000000份。本发明的有益效果为：该培养基在与血清替代组分KSR以及二甲基亚砜复配得到的用于脂肪干细胞的冻存液具有优异的冻存效果。
用于脂肪干细胞冻存液及其制备方法以及培养基

[发明专利]一种干细胞定向分化培养体系-CN201610933428.0在审
发明人： 陈继冰;吴振化 -专利权人：浙江译美生物科技有限公司
申请日： 2016-10-25 - 公布日： 2017-03-22 - 主分类号： C12N5/071 文献下载
摘要：本发明公开了一种干细胞定向分化培养体系，包括培养基，用于培养干细胞和体细胞；细胞载体，所述细胞载体包含中部的空腔、设置于所述细胞载体外表面的一层PIPAAm膜、贯穿所述细胞载体内外的通孔和插接于所述通孔内的密封塞。本发明具有以下优点和效果采用在细胞载体上设置通孔，使得细胞载体内壁的体细胞和细胞载体外壁的干细胞在细胞间接触，促进干细胞的分化，同时在细胞载体外壁设置一层PIPAAm膜，使得在分离体细胞和分化后的干细胞时不需要采用生物酶处理，达到了分化后分离方便、干细胞分化率高的效果。
一种干细胞定向分化培养体系

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