[发明专利]一种利用毕赤酵母生产皮蝇素C的方法

摘要

本发明公开一种利用毕赤酵母生产皮蝇素C的方法，包括如下步骤：首先用PCR扩增HC基因，酶切重组载体和片段HC，用连接酶连接后形成含有HC的重组质粒，将重组产物转入大肠杆菌，然后将含有HC的重组质粒酶切，线性化后通过电击转化入制备好的酵母感受态细胞中进行培养，筛选出多拷贝质粒菌株，对筛选出的细胞进行培养，离心收集细胞，进行诱导表达，最后将收集的上清液浓缩后，于缓冲液中透析、过滤，用阴离子交换层析柱纯化透析蛋白，收集含目的蛋白的洗脱液。本发明是一种低廉且产量高的表达HC的方法，毕赤酵母具有原核表达系统快速、简单、低廉的优点，其最大的优点是它自身分泌的蛋白很少，有利于纯化。

主权项

1.一种利用毕赤酵母生产皮蝇素C的方法，其特征在于：所述的方法包括如下步骤：(1)根据皮蝇素C基因全长cDNA序列，设计含EcoR I和Not I酶切位点的特异性引物，用PCR扩增出如SEQ ID NO：1所示的皮蝇素C基因，用EcoR I和Not I分别酶切重组载体和片段皮蝇素C基因，并用连接酶将其连接，形成含有皮蝇素C基因的重组质粒，将重组产物转入大肠杆菌，酶切、PCR鉴定、测序确认；(2)将含有皮蝇素C基因的重组质粒以Sal I进行酶切，线性化后的重组质粒通过电击转化入制备好的酵母感受态细胞中进行培养，筛选出多拷贝质粒菌株；(3)对筛选出的细胞进行培养，待菌液OD600值达2-6时离心收集细胞，然后进行诱导表达；(4)将收集的上清液浓缩后，于缓冲液中透析、过滤，用阴离子交换层析柱纯化透析蛋白，收集含目的蛋白的洗脱液。