本发明公开一组柞蚕微孢子虫检测引物及其应用,具体的所述引物碱基序列如SEQ ID NO.1~3所示,其模板提取的方法为,应用碱裂解结合磁珠进行DNA的释放、富集、分离与纯化,该引物特异性好,灵敏度高,利用该引物建立的柞蚕微孢子虫检测方法操作简单快速、成本低、通量高、能活蛹取样、抗干扰能力强、污染风险低,提取的DNA品质高、可自动化。该方法可以广泛应用于分子学检测中,能显著提高检测通量、操作便利性,并显著降低检测假阳性率,提高检测灵敏度、准确度和检测效率;对柞蚕产业集中检疫柞蚕微粒子病和种质资源保护具有重要意义。