本发明公开了茯苓酸合成的关键基因及应用,该茯苓酸合成的关键基因,核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;关键基因包括PcCPR和CYP5035,PcCPR的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示,CYP5035的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;PcCPR和CYP5035均在pESC‑Trp载体质粒上;PcCPR和CYP5035均位于半乳糖启动子之后;PcCPR位于GAL10启动子之后,CYP5035位于GAL1启动子之后,GAL10启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示,GAL1启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。本发明通过大量前期筛选和实验,找到了以羊毛甾醇为底物,进行C‑16羟基化和C‑20甲基羧基化的茯苓酸合成关键酶基因CYP5035;本发明有望构建完整的茯苓酸生物合成通路,阐释茯苓活性物质合成的内在品质属性,也可为茯苓酸生物合成细胞工厂研究应用提供数据支持,促进中药资源的创新发展。