本发明公开了一种烟草烟碱代谢相关的基因及其应用,该基因为NtLNP2基因,其序列为SEQ ID No.1,对该基因的序列进行翻译后,其所编码蛋白序列为SEQ ID No.2。利用CRISPR/Cas9系统敲除烟草烟碱代谢相关的基因的方法,包括以下步骤:(1)sgRNA引导序列的设计,sgRNA表达载体的构建;(2)将表达载体导入农杆菌;(3)侵染愈伤组织;(4)以GC‑MS进行NtLNP2基因纯合敲除素材的现蕾期叶片的烟碱含量的检测试验。本申请的基因和方法为烟草烟碱代谢基因功能研究及低烟碱烟草新品种培育研究提供遗传材料和理论依据。