[发明专利]一种可视化检测H5亚型禽流感病毒的引物探针组及其应用和含有该引物探针组的产品

说明书

本发明涉及病毒检测技术领域，本发明提供了一种可视化检测H5亚型禽流感病毒的引物探针组及其应用和含有该引物探针组的产品，包括上游引物H5‑F、下游引物H5‑R和探针H5‑P；所述上游引物H5‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述下游引物H5‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述探针H5‑P的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明提供的引物探针组合，可以特异性结合到H5‑AIV的RNA上，准确检测出H5‑AIV，且与H3、H7、H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒等均无交叉扩增反应，特异性强，灵敏度高，对H5‑AIV的最低检测限为1copies/μL。

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，尤其涉及一种可视化检测H5亚型禽流感病毒的引物探针组及其应用和含有该引物探针组的产品。

背景技术

H5亚型禽流感病毒为正粘病毒科，禽流感病毒A属，有囊膜，为单股正链RNA病毒，主要感染鸡、火鸡、鸭等。作为高致病性禽流感病毒，其对家禽养殖业造成了巨大经济损失。同时，作为人畜共患病，还严重威胁人类健康。作为一种传染性高、致病力强的高致病型禽流感病毒，对其进行早期诊断监测，从而降低大规模爆发的风险是重中之重。目前，用于H5亚型禽流感病毒检测的传统方法主要有病毒分离法、反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)、血凝和血抑试验(HA、HI)以及荧光定量PCR等。但由于病毒分离耗时长，不适于大规模检测，且需要BSL-3实验室；RT-PCR方法耗时长，荧光定量PCR方法仪器昂贵、需专业人员进行操作等满足不了快速准确地检测H5亚型禽流感病毒。因此，急需一种检测快速、灵敏度高、结果判断准确的H5亚型禽流感病毒检测方法。

重组酶辅助扩增技术(RAA)作为一种新型的等温扩增技术，因其具有耗时短，操作便携、特异性强，灵敏度高等特点被广泛应用于病毒、细菌和寄生虫的检测。RAA可在37～42℃恒温环境下，30min内实现病毒核酸的快速扩增。侧流层析试纸条技术(LFD)是一种便携式的辅助工具，被用于核酸、抗原、抗体的诊断，其结果肉眼可见。近年来，LFD与RAA结合被应用于新城疫病毒、非洲猪瘟病毒、新型冠状病毒、肺炎克雷伯菌等病原的检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可视化检测H5亚型禽流感病毒的引物探针组及其应用和含有该引物探针组的产品，可在37～42℃条件下实现H5-AIV核酸的快速检测，并使用试纸条可以实现在现场快速筛查H5-AIV，为H5-AIV的防控提供技术支撑。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种可视化检测H5亚型禽流感病毒的引物探针组，包括上游引物H5-F、下游引物H5-R和探针H5-P；

所述上游引物H5-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述下游引物H5-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述探针H5-P的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

作为优选，所述下游引物的5′端标记有生物素，所述探针的5′端标记有荧光基团，所述探针的3′端进行C3-spacer封闭修饰。

本发明还提供了所述的引物探针组在制备检测H5-AIV的产品中的应用。

作为优选，所述产品为侧流层析试剂盒或试纸条。

本发明还提供了一种检测H5-AIV的侧流层析试剂盒，包括上游引物H5-F、下游引物H5-R、探针H5-P。

作为优选，所述试剂盒中还包括荧光缓冲液、乙酸镁溶液、RAA干粉试剂和ddH₂O；

所述荧光缓冲液(ABuffer)、乙酸镁溶液(B Buffer)、RAA干粉试剂来源于杭州众测生物科技有限公司的RT-RAA核酸扩增试剂盒(荧光型)(S004ZC)。