[发明专利]核苷酸衍生物及其使用方法

权利要求书

1.一种方法，其包括与单链DNA接触，其中所述单链DNA与聚合酶结合，所述聚合酶又与电解质溶液中的膜包埋纳米孔连接，其中单链DNA具有与其一部分杂交的引物，以及根据以下步骤确定单链DNA模板的序列：

(a)添加包括与锚部分连接的3'-O-可切割接头(DTM)的四种核苷酸，其中所加入的合适的核苷酸类似物与所述单链DNA(模板)的下述核苷酸残基互补：所述核苷酸残基在5'方向上紧邻所述单链DNA中的核苷酸残基，

并通过DNA聚合酶在所述引物的3'末端核苷酸残基处掺入从而形成DNA延伸产物，其中由于3'-O被可切割接头和锚部分保护，仅有单个3'-O-锚可切割接头(DTM)核苷酸将添加到所述引物中，从而阻止在该步骤中进一步掺入；

(b)将连接有对应于步骤(a)中的4种锚的不同结合分子的4种不同的纳米孔标签添加至经延伸的引物；具有标签的合适的结合分子将与步骤(a)中掺入的3'-O-锚核苷酸共价结合或复合；

(c)跨膜施加电压并测量由步骤(b)中形成的连接于其上标签迁移通过纳米孔所造成的跨过纳米孔的电子(离子电流)变化，其中电子变化对于每种不同类型的标签而言是不同的，从而鉴定与掺入的带标签的核苷酸互补的、单链模板DNA中的核苷酸残基；

(d)通过用合适的切割剂处理来切割3'-O-可切割接头连接的标签，从而产生准备用于下一个延伸反应的游离3'-OH；

(e)对所测序的单链DNA的每个核苷酸残基重复地进行步骤(a)-(d)，其中如果3'-O-可切割锚核苷酸与单链(模板)DNA的下述核苷酸残基互补：所述核苷酸残基在5'方向上紧邻单链DNA中与DNA延伸产物的3'末端核苷酸残基杂交的核苷酸残基，则在每次重复的步骤(a)中将3'-O-可切割锚核苷酸掺入前一次重复的步骤(d)产生的DNA延伸产物中，从而确定单链DNA的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述核苷酸类似物具有下式：

其中，

符号“----”是非共价键；

B为碱基或其类似物；

L¹为共价接头；

L²为共价接头；

L⁴为共价接头；

X为键、O、NR^6A或S；

R³为三磷酸酯或更高级的多磷酸酯；

R^4A为氢、-CF₃、-CC1₃、-CBr₃、-CI₃、-CHF₂、-CHCl₂、-CHBr₂、-CHI₂、-CH₂F、-CH₂Cl、-CH₂Br、-CH₂I、-CN、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基；R^6A为氢、-OH、-CF₃、-CCl₃、-CBr₃、-CI₃、-CHF₂、-CHCl₂、-CHBr₂、-CHI₂、-CH₂F、-CH₂C1、-CH₂Br、-CH₂I、-CN、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基；

R⁵为可检测标签、锚部分或亲和锚部分；

R⁶为-CF₃、-CCl₃、-CBr₃、-CI₃、-CHF₂、-CHCl₂、-CHBr₂、-CHI₂、-CH₂F、-CH₂C1、-CH₂Br、-CH₂I、-CN、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基；

R⁷为氢或-OR^7A，其中R^7A为氢或聚合酶相容的部分；

R¹²为互补的亲和锚部分结合子；

R¹³为可检测标签，

其中所述可检测标签为分子量为至少140道尔顿的荧光染料。