[发明专利]核苷酸类似物及其在测序中的应用

说明书

本发明公开了核苷酸类似物及其在测序中的应用。本申请的第一方面，提供一种结构式具有如式(Ⅰ)所示的化合物。该化合物在核苷酸上引入正交断裂基团，这样作为可逆终止子的替代掺入引物进行延伸时，可以通过反电子需求狄尔斯‑阿尔德(IEDDA)反应快速切除作为保护基的正交断裂基团，从而暴露出3′‑OH进行下一轮的的生化反应，大大缩短了测序过程中的反应时间，phasing值得以降低，最终可以降低测序过程中的错误率、提高测序的准确率。

技术领域

本申请涉及核苷酸技术领域，尤其是涉及核苷酸类似物及其在测序中的应用。

背景技术

二代测序(Next-generation sequencing，NGS)又称为高通量测序(High-throughput sequencing)，是基于PCR和基因芯片发展而来的DNA测序技术。二代测序开创性地引入了可逆终止子，从而实现边合成边测序(Sequencing by Synthesis)。其基本原理在于，在DNA复制过程中通过捕捉新添加的碱基所携带的特殊标记(一般为荧光分子标记)来确定DNA的序列。为了实现每个循环只检测一个碱基，碱基的添加过程需要使用携带标记的含有阻断基团的核苷酸类似物作为可逆终止子，以此将其与目标核酸、DNA聚合酶进行生化反应，使用目标核酸作为模板延伸引物掺入核苷酸类似物，具有阻断基团的核苷酸类似物会终止引物的下一步延伸，直至加入去阻断试剂，方能进行下一步生化反应。如此循环重复多次，在每个循环中检测其携带的特殊标记，分析得到目标核酸的序列。例如，核苷酸中引入叠氮甲基作为阻断基团保护核苷酸3′-OH所得到的核苷酸类似物，在参与目标核酸的延伸过程中，会阻断下一个碱基的掺入，光学检测分析后，加入三价磷试剂对叠氮甲基进行切除，再进行下一轮生化反应，如此循环多次，并在每个循环中检测，即可得到核酸序列。

在二代测序过程中，定相(phasing)是指边合成边测序过程中，由于3′终止子和荧光团的不完全除去，DNA链的一部分不能通过聚合酶在下一轮的测序循环中完全并入到簇中。而预定相(Pre-phasing)则是在不存在有效的3′终止子的情况下核苷酸类似物的并入，并且该并入过程预先1个循环进行。以叠氮甲基保护的荧光标记的核苷酸为例，叠氮基团在合成过程中需要使用叠氮化钠，叠氮化钠具有爆炸性。同时作为有机叠氮化合物，测序生化反应温度下，其热稳定性较差，叠氮甲基容易脱落暴露出3′-OH，引起测序中下一轮生化反应，导致Pre-phasing值偏高。另外，有机叠氮化合物在储存转移过程中容易受到还原剂的影响；而切除叠氮甲基又需要用到易氧化的三价磷试剂等还原剂。此外，使用切除试剂时，切除时间及切除效率影响着下一个生化反应，切除不完全会影响phasing值过高，切除反应时间过长，效率过低，会影响测序生化反应时间，增加测序成本等问题。因此，有必要提供一种供测序使用的核苷酸类似物，可以降低测序过程中反应时间，降低测序过程中phasing值，最终能降低错误率，提高准确率。

发明内容

本申请旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本申请提出一种核苷酸类似物及其在测序中的应用，这一核苷酸类似物作为测序中可逆终止子的替代，可以被快速切除以暴露3′-OH，降低测序过程中反应时间，降低测序过程中phasing值，最终能降低错误率，提高准确率。

本申请的第一方面，提供一种结构式具有如式(Ⅰ)所示的核苷酸类似物：

其中，R¹包括任选的正交断裂基团；

R²包括碱基；

R³包括羟基、磷酸酯基团中的任一种；

R⁴包括氢、OR⁵中的任一种，R⁵为任选的正交断裂基团；

R¹、R²、R³、R⁴中的至少一个还连接有可检测的标签。