[发明专利]脓毒血症病原体检测的组合物、试剂盒、方法及其用途

说明书

本发明属于分子生物学检测领域，具体地，涉及脓毒血症病原体的检测，更具体地，涉及人葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌和粪肠球菌的检测。本发明提供的联检的组合物，主要利用多重荧光PCR分析方法，通过检测不同病原体上的靶点，对不同病原体进行检测，从而在单管反应体系中同时实人葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌和粪肠球菌的检测和区分。本发明的组合物，其检测的灵敏度更高，达到500拷贝/mL，特异性好，检测更为准确。

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，具体地，涉及脓毒血症病原体的检测，更具体地，涉及人葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌和粪肠球菌的检测。

背景技术

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)是一种临床常见的革兰阴性杆菌，广泛分布于自然界，亦存在于健康人与动物的呼吸道和肠道中。当机体免疫力下降或长期使用抗生素导致菌群失调时可引起感染。可引起社区及医院获得性感染，导致肺炎、肝脓肿、泌尿系统感染以及血流感染等多种感染性疾病。近年来，肺炎克雷伯菌感染事件高发，是引起社区获得性感染与医院院内感染不可忽视的潜在病原体。肺炎克雷伯菌毒力因子主要包括：荚膜多糖(K抗原)、Ⅰ型菌毛、脂多糖(O抗原)、铁摄入能力等。荚膜多糖是肺炎克雷伯菌的主要毒力因子。根据荚膜多糖(K抗原)分型，可将肺炎克雷伯菌分为82个K血清型。其中K1、K2和K5血清型与人和动物体的严重感染性疾病有密切关系。相比其他血清型，K1、K2、K54和K57型为强毒力菌株，常见于肺炎病例中。尤其以K1和K2型毒力最强，近年来流行趋势日趋严重。

粪肠球菌(Enterococcus faecalis)为肠球菌属中的一种革兰氏阳性兼性厌氧菌。该菌作为人类肠道中的正常优势菌群，具有维持正常肠道菌群结构的重要作用，在肠黏膜具有较强的耐受和定植能力。同时，粪肠球菌也是常见的条件致病菌，致病性粪肠球菌引起的感染有尿路感染、化脓性腹部感染、败血症、心内膜炎、腹泻和发烧等。此外，粪肠球菌对环境适应力和抵抗性强，可耐受四环素、卡那霉素、庆大霉素等多种抗生素。粪肠球菌可引起医源感染，最常见的为尿道器械操作、导尿等引起的尿道感染，其次为腹腔和盆腔等部位的创伤和外科术后感染。由于粪肠球菌细胞壁厚，与其他病原菌相比，其特殊生物性特性更容易出现耐药性，且近年来粪肠球菌引起的感染呈上升趋势，出现耐药性转移现象，因此鉴于粪肠球菌潜在的致病风险，早期及时诊断病原体感染具有重要意义。

人葡萄球菌(Staphylococcus hominis)属于凝固酶阴性葡萄球菌(CoNS)的第三种，因其能够在人体光滑装置表面形成生物膜的能力，被认为是一种潜在的病原体，可在免疫功能低下的患者中引起感染性心内膜炎、脑膜炎等不同感染，通常从医院获得性感染患者的标本中分离，在医疗设备或宿主组织上形成稳定的生物膜被认为是其主要致病性因素。但是人葡萄球菌是一种罕见的条件致病菌，只有在机体免疫力低下时才可能引起机体各部位机会性感染，因此是新生儿和免疫抑制患者血液中最常见的三种分离株之一，并被认为是菌血症、败血症和心内膜炎的病因。

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)又称为绿脓杆菌，属于革兰阴性杆菌，潮湿的环境是它存在重要的条件，广泛分布在自然界中的水、空气和土壤中，还定植在人类的皮肤表面、消化道和呼吸道等部位。铜绿假单胞菌是条件致病菌，易引发体质虚弱、抵抗力差的患者感染，如老年患者、术后患者。铜绿假单胞菌具有易定植和耐药机制复杂等特点。它可以引起人体多部位感染，如消化道、呼吸道、尿路感染、肺部、心脏瓣膜和手术部位感染，甚至引起血流感染。铜绿假单胞菌是临床常见致病菌，它引发的感染位居导致院内感染的革兰阴性菌前列，并呈上升趋势，已成为重点防控的的病原菌之一。

上述人葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌和粪肠球菌均可引起败血症，危及生命安全，因此早期诊断病原体并给予及时有效的抗感染治疗是改善预后的关键，能够大大降低发病率和病死率。然而，通过临床症状和常规的实验室检测很难鉴别确定所感染的细菌种类，而且目前细菌培养条件较苛刻，造成培养阳性率低，且多重混合感染的培养极为困难，这给感染患者及临床医生带来很大困扰。