[发明专利]一种丛枝菌根真菌共生作用下的根际简化细菌菌群的筛选方法

说明书

本发明公开了一种丛枝菌根真菌共生作用下的根际简化细菌菌群的筛选方法。属于菌群筛选技术领域。本发明方法包括如下步骤：丛枝菌根真菌共生作用下的根际细菌分离、根际微生物群的筛选、简化细菌菌群的构建和简化细菌菌群功能鉴定。本发明运用多种丛枝菌根真菌进行共生培养，利用多种有差异共生能力的菌株开展研究来构建的极简微生物组更具有普遍性。本发明利用16srRNA基因高通量测序技术与宏基因测序技术结合，使筛选的根际细菌更具有可靠性。本发明利用根际细菌分离纯化，并使用不同功能筛选培养基去鉴定其菌群菌株的功能，以筛选和鉴定与AM真菌相互作用的促生根际细菌，对于AM真菌共生效应的基础研究及广泛应用，具有重要意义。

技术领域

本发明涉及菌群筛选技术领域，更具体的说是涉及一种丛枝菌根真菌共生作用下的根际简化细菌菌群的筛选方法。

背景技术

根际对植物健康至关重要，它包含一个复杂的微生物群落，被称为植物的第二基因组。植物根系向根际释放养分、分泌物、边缘细胞和粘液，细菌、真菌(包括丛枝菌根真菌)、卵菌、病毒和古细菌被根际沉积物吸引并以它们为食。然而，根和微生物之间的直接相互作用是最重要的，并且极大地影响植物的生长、健康和适应。植物对根际微生物群落的相对丰度和组成具有物种特异性影响，不同植物生长在同一土壤中会发展出不同的微生物群落。除了植物的调节外，微生物相互作用还可以调节根际微生物群落。

丛枝菌根(AM)真菌与超过三分之二的陆生植物形成共生关系。在共生关系中，AM真菌以多种方式促进植物生长，尤其是通过增加对磷、氮和钾的吸收。但是，对几种AM真菌全基因组进行研究发现，与腐生真菌或外生菌根真菌的基因组相比，AM真菌具有特别少的外酶谱，其编码碳水化合物降解酶(CAZys)的基因较少，尤其是缺乏糖苷水解酶(GHs)，如GH6、GH7。此外，AM真菌缺乏编码植酸酶的基因，该酶能水解土壤中有机磷的主要形式—植酸。这表明，与其他真菌相比，AM真菌对土壤有机养分的直接活化能力相对较弱。然而，定殖在AM真菌菌丝际的土壤微生物可能极大地促进了土壤有机养分的周转，弥补了AM真菌缺失的功能。迄今为止，大多数研究都集中在微生物-根系的相互作用上，但AM真菌和根际微生物的相互作用及其对植物生长的影响在很大程度上仍未得到探索。菌根生物技术最近在改善退化土壤和保护环境的生物修复中变得不可或缺。AM真菌通过联合根际微生物群来开发土壤中的有机养分(如氮和磷)资源，通过菌根途径提高养分吸收效率，具有重要的生态和农学意义。

因此，发明一种丛枝菌根真菌共生作用下的根际简化细菌菌群的筛选方法，对于AM真菌共生效应的基础研究及广泛应用，具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种丛枝菌根真菌共生作用下的根际简化细菌菌群的筛选方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种丛枝菌根真菌共生作用下的根际简化细菌菌群的筛选方法，包括如下步骤：

步骤一：丛枝菌根真菌共生作用下的根际细菌分离

收集丛枝菌根真菌共生的根际土壤，利用质量浓度0.9％的NaCl无菌溶液对根际土壤进行重悬和梯度稀释，将稀释液涂布到细菌培养基中，对根际细菌进行分离；

步骤二：根际微生物群的筛选

1)对根际土壤样品DNA进行提取，制备插入片段长度为500bp的文库，进行宏基因组测序；同时，以根际土壤样品DNA为模板进行16S rRNA PCR扩增并纯化，构建PE文库，进行16S rRNA基因高通量测序；

2)将16S rRNA基因高通量测序数据进行拼接和质量控制，得到优化数据，进行ASV聚类，对ASV注释，之后进行物种相对丰度分析、α多样性分析、β多样性分析以及物种差异与相关性网络分析；