[发明专利]一种丛枝菌根真菌共生作用下的根际简化细菌菌群的筛选方法

权利要求书

1.一种丛枝菌根真菌共生作用下的根际简化细菌菌群的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一：丛枝菌根真菌共生作用下的根际细菌分离

收集丛枝菌根真菌共生的根际土壤，利用质量浓度0.9％的NaCl无菌溶液对根际土壤进行重悬和梯度稀释，将稀释液涂布到细菌培养基中，对根际细菌进行分离；

步骤二：根际微生物群的筛选

1)对根际土壤样品DNA进行提取，制备插入片段长度为500bp的文库，进行宏基因组测序；同时，以根际土壤样品DNA为模板进行16S rRNA PCR扩增并纯化，构建PE文库，进行16SrRNA基因高通量测序；

2)将16S rRNA基因高通量测序数据进行拼接和质量控制，得到优化数据，进行ASV聚类，对ASV注释，之后进行物种相对丰度分析、α多样性分析、β多样性分析以及物种差异与相关性网络分析；

3)对宏基因组测序的原始数据进行处理，得到有效数据，之后计算基因在根际样本的丰度信息，将基因集与NR、KEGG、eggNOG、ARDB、CAZy、SEED进行比对，获得基因的物种注释信息和功能注释信息；

4)对16S rRNA基因高通量测序数据的分析结果和宏基因组数据进行整合分析，利用随机森林分析、LEfSe分析和相关性网络分析，结合宏基因组的功能分析结果，筛选出丛枝菌根真菌介导的关键根际细菌菌群；筛选原则是筛选原则是富集在根际具有氮磷钾代谢功能的细菌；

步骤三：简化细菌菌群的构建

1)对步骤一分离到的根际细菌进行种属鉴定；

2)将第1)步鉴定的种属与步骤二分析得到的丛枝菌根真菌介导的关键根际细菌菌群，进行整合分析，找到步骤一和步骤二中相同的菌属，构建简化细菌菌群，并对简化菌群进行纯化培养和保藏；

步骤四：简化细菌菌群功能鉴定

对简化细菌菌群的固氮、解磷和解钾功能进行鉴定，最终确定丛枝菌根真菌共生作用下的根际简化细菌菌群。

2.如权利要求1所述的一种丛枝菌根真菌共生作用下的根际简化细菌菌群的筛选方法，其特征在于，所述细菌培养基为牛肉膏蛋白胨培养基、R2A培养基和大豆酪蛋白琼脂培养基。

3.如权利要求1所述的一种丛枝菌根真菌共生作用下的根际简化细菌菌群的筛选方法，其特征在于：所述步骤二中的16S rRNA基因高通量测序区域为V3-V4；

测序平台为Illumnia Mi-seq 2×300bp；

测序引物为：

341F:CCTACGGGNGGCWGCAG，SEQ ID NO:1；

805R:GACTACHVGGGTATCTAATCC，SEQ ID NO:2。

4.如权利要求1所述的一种丛枝菌根真菌共生作用下的根际简化细菌菌群的筛选方法，其特征在于，所述步骤四中的氮、磷和钾筛选培养基为NFM培养基、OPDB培养基、无机磷筛选培养基和解钾细菌筛选培养基，各培养基组分如下：

每1000g NFM培养基包括如下组分：K₂HPO₄ 0.20g，KH₂PO₄ 0.50g，MgSO₄.7H₂O 0.20g，FeSO₄·7H₂O 0.10g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.005g，NaCl 0.20g，glucose 10.00g和琼脂15.00g；

每1000g OPDB培养基包括如下组分：葡萄糖10.0g，(NH₄)₂SO₄ 0.5g，NaCl 0.3g，KCl0.3g，yeast extract 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，FeSO₄·7H₂O 0.03g，MnSO₄·4H₂O 0.03g，CaCO₃ 5.0g，soybean lecithin15.0g和Bacto-agar 15.0g；

每1000g无机磷筛选培养基包括如下组分：葡萄糖10.0g，(NH₄)₂SO₄ 0.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，yeast extract 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，FeSO₄·7H₂O 0.03g，MnSO₄·4H₂O0.03g，CaCO₃ 5.0g，Ca₃(PO₄)₂ 15.0g和Bacto-agar 15.0g；

每1000g解钾细菌筛选培养基包括如下组分：glucose 3.50g，MgSO₄.7H₂O 0.50g，CaCO₃0.10g，FeCl₃ 0.0005g，Ca₃PO₄ 2.00g和不溶性钾长石粉1.0g。