[发明专利]一种基于环境DNA扩增监测玉足海参生物量的引物和方法

说明书

本发明公开了一种基于环境DNA扩增监测玉足海参生物量的引物和方法。该引物序列为：Hl‑F：5’‑CATTCTACTCCTCGCCTCAGCG‑3’，Hl‑R：5’‑GGGTTCGCATGTTTATGAC‑3’。所述的监测玉足海参生物量方法的步骤为：1)制作玉足海参目的片段拷贝数与Ct值的标准曲线；2)根据标准曲线测定不同海域下玉足海参的Ct值；3)将测得的玉足海参Ct值与对应的玉足海参目的片段拷贝数与Ct值的标准曲线比较，计算出调查海域的玉足海参目的片段的拷贝数。本发明提供的方法可通过收集海域底层水体样品，对其中玉足海参产生的痕量DNA识别，并根据eDNA中目的片段拷贝数评估玉足海参的生物量。

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，具体涉及一种基于环境DNA扩增监测玉足海参生物量的引物和方法。

背景技术

玉足海参(Holothuria leucospilota)隶属棘皮动物门(Echinodermata)，海参纲(Holothuroidea)，楯手目(Aspidochirotida)，海参科(Holothuriidae)，海参属(Holothuria)，广泛分布于印度-西太平洋海域。有研究表明，玉足海参对海底沉积物具有强大的过滤以及对于沉积物中有机质的强大清除作用，因此玉足海参在海洋生态系统中占据着关键的生态位。受到人类活动等因素的影响，我国玉足海参的资源已经严重匮乏，基于玉足海参对海洋生态系统中的重要角色，掌握其在海洋中的分布和生物量是开展资源养护以及生态增养殖的重要基础工作。

环境DNA(environmental DNA,eDNA)最早被应用于环境微生物方面的研究，其主要被用于分离和纯化沉积物中的微生物DNA，但eDNA技术真正得到认可和应用是在本世纪初。该技术首次应用于水体中生物的监测，是对一湿地区域进行入侵物种美国牛蛙(Ranacatesbeiana)的监测。随着技术的不断成熟，其应用范围也越来越广，例如：通过对eDNA的PCR扩增产物进行高通量测序(High-throughput sequencing)以分析环境中某种生物的种群组成，或采用实时定量PCR(real-time qPCR)以分析单一物种生物量的时空变化。环境DNA技术与传统的调查方法相比，具有高效、高性价比以及无损伤等特点，因此具有在难以调查取证的海洋生物量调查中应用的潜力。

由于海参属于底栖海洋动物，且多栖息于礁石洞隙，这为人工潜水调查海参的生物量带来了巨大的挑战。迄今为止，国内外均没有被广泛认可的调查海参的生物量的科学规范方法，在十分稀少的文献报道中，主要采用人工潜水拉样带的调查方法。现代分子技术的进步为开发新颖的海参生物量调查方法提供了契机。

发明内容

本发明的第一个目的是提供的一种基于环境DNA扩增监测玉足海参生物量的引物，包含一条正向引物(Hl-F)和一条反向引物(Hl-R)，其序列为：

Hl-F：5’-CATTCTACTCCTCGCCTCAGCG-3’；

Hl-R：5’-GGGTTCGCATGTTTATGAC-3’。

本发明的第二个目的是提供上述的引物在制备基于环境DNA扩增监测玉足海参生物量的试剂盒中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种基于环境DNA扩增监测玉足海参生物量的试剂盒，其包含上述的引物。

本发明的第四个目的是提供一种基于环境DNA扩增监测玉足海参生物量的方法，其包括以下步骤：

(1)以玉足海参的基因组DNA为模板，使用引物Hl-F/Hl-R进行PCR扩增；将PCR产物与质粒载体连接并扩大培养；提取质粒；计算质粒拷贝数并梯度稀释；以梯度稀释后的质粒为模板，使用引物Hl-F/Hl-R进行qPCR扩增，制作玉足海参目的片段拷贝数与Ct值的标准曲线；

(2)采集不同海域环境下的底层海水，采用过滤法收集并提取水体中的eDNA，以水体eDNA作为模板，使用引物Hl-F/Hl-R进行qPCR检测，记录Ct值；