[发明专利]一种基于环境DNA扩增监测玉足海参生物量的引物和方法

权利要求书

1.一种基于环境DNA扩增监测玉足海参生物量的引物，其特征在于，所述的引物为：Hl-F：5’-CATTCTACTCCTCGCCTCAGCG-3’，Hl-R：5’-GGGTTCGCATGTTTATGAC-3’。

2.权利要求1所述的引物在制备基于环境DNA扩增监测玉足海参生物量的试剂盒中的应用。

3.一种基于环境DNA扩增监测玉足海参生物量的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的引物。

4.一种基于环境DNA扩增监测玉足海参生物量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以玉足海参的基因组DNA为模板，使用权利要求1所述的引物Hl-F/Hl-R进行PCR扩增；将PCR产物与质粒载体连接并扩大培养；提取质粒；计算质粒拷贝数并梯度稀释；以梯度稀释后的质粒为模板，利用权利要求1所述的引物Hl-F/Hl-R进行qPCR扩增，制作玉足海参目的片段拷贝数与Ct值的标准曲线；

(2)采集不同海域环境下的底层海水，采用过滤法收集并提取水体中的eDNA，以水体eDNA作为模板，使用权利要求1所述的引物Hl-F/Hl-R进行qPCR检测，记录Ct值；

(3)根据步骤(1)得到的玉足海参目的片段拷贝数与Ct值的标准曲线，以及步骤(2)得到的海水eDNA样品的Ct值，计算出水体中玉足海参eDNA拷贝数；然后将水体中玉足海参eDNA拷贝数与对应的玉足海参目的片段拷贝数与Ct值的标准曲线比较，据此估算玉足海参的生物量。

5.根据权利要求4所述的基于环境DNA扩增监测玉足海参生物量的方法，其特征在于，步骤(1)中质粒梯度稀释后的目的片段拷贝数分别为10⁸copies/μL、10⁷copies/μL、10⁶copies/μL、10⁵copies/μL、10⁴copies/μL、10³copies/μL、10²copies/μL。

6.根据权利要求4所述的基于环境DNA扩增监测玉足海参生物量的方法，其特征在于，步骤(1)中PCR的反应体系为：玉足海参基因组DNA 1μL，2×SYBR Green Pro Taq HSPremix 10μL，10-20μM/μL正向引物Hl-F 0.4μL，10-20μM/μL反向引物Hl-R 0.4μL，ddH₂O8.2μL，共20μL；反应条件为：95℃ 30sec；95℃ 5sec，60℃ 30sec，40个循环。

7.根据权利要求4所述的基于环境DNA扩增监测玉足海参生物量的方法，其特征在于，步骤(1)中qPCR的反应体系为：质粒DNA 1μL，2×SYBR Green Pro Taq HS Premix 10μL，10-20μM/μL正向引物Hl-F 0.4μL，10-20μM/μL反向引物Hl-R 0.4μL，ddH₂O 8.2μL，共20μL；反应条件为：95℃ 30sec；95℃ 5sec，60℃ 30sec，40个循环。

8.根据权利要求4所述的基于环境DNA扩增监测玉足海参生物量的方法，其特征在于，步骤(2)中qPCR的反应体系为：水体eDNA 1μL，2×SYBR Green Pro Taq HS Premix 10μL，10-20μM/μL正向引物Hl-F 0.4μL，10-20μM/μL反向引物Hl-R 0.4μL，ddH₂O 8.2μL，共20μL；反应条件为：95℃ 30sec；95℃ 5sec，60℃ 30sec，40个循环。

9.根据权利要求4所述的基于环境DNA扩增监测玉足海参生物量的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的过滤法是使用孔径为0.22μm的滤膜过滤。

10.权利要求1所述的引物、权利要求3所述的试剂盒或权利要求4所述的方法在监测玉足海参生物量中的应用。