[发明专利]一种用于结直肠癌诊断的多基因DNA甲基化联合检测试剂盒及应用

说明书

本发明属于生物医学检验技术领域，具体涉及一种基于荧光定量PCR技术的结直肠癌多基因甲基化联合检测试剂盒及其临床应用。本发明通过联合检测外周血单个核细胞中TRGV9、TRDJ3、TRDC、FAM174B、ZMIZ2基因甲基化水平，能够有效判断结直肠癌的发生情况。与焦磷酸测序等技术相比，本发明操作简便，大大降低检测成本，提高检测效率，可在基层医院开展，有望实现对结直肠癌进行高灵敏度、高特异性的筛查诊断，具有较高的临床使用和推广价值。

技术领域

本发明属于基因工程技术技术领域，涉及一种基于结直肠癌TRGV9、TRDJ3、TRDC、FAM174B、ZMIZ2多基因DNA甲基化检测的诊断试剂盒、检测方法及其临床应用。

背景技术

2018年全球癌症统计数据显示，结直肠癌(CRC)在全球发病率排名第三，死亡率排名第二，估计新发病例约200万/年，死亡人数超过88万/年。研究人员普遍认为，提高CRC的诊断水平是进一步降低CRC发病率和死亡率的最有效策略。目前，根据CRC筛查指南，结肠镜检查和粪便免疫化学试验(FIT)已被推荐为CRC筛查的一线选择。然而，结肠镜检查的是侵入性操作、肠道准备繁琐、并发症较难避免且费用昂贵，患者依从性较差。FIT是一种非侵入性测试，可以提高参与率，但检测的敏感性较低。定期检测癌胚抗原(CEA)能够为CRC提供可靠的指征，特异性和敏感性仍不满足临床需求。因此，仍然亟需开发一种基于血液的用于CRC诊断的无创、准确的检测方法。

越来越多的证据表明，在表观遗传改变中，DNA甲基化的异常改变被认为是包括CRC在内的许多癌症类型发生和发展过程中的最主要现象，并且它们可以在早期肿瘤中癌症患者非侵入性基质中(如血清、血浆或外周血单个核细胞(PBMC)被检测到。而PBMC可从常规采集的血液中轻松获取，且能够提供与癌症进展相关的潜在生物分子(如DNA、RNA和蛋白质等)，从而识别肿瘤的存在。学者能够从PBMCs基因表达模式中进一步检测到这种信号，使得差异DNA甲基化位点的检测可作为癌症诊断的标志物也成为一个新的研究方向。

近年来已有文献报道包括CRC在内的不同类型癌症中鉴定癌症特异性DNA甲基化生物标志物的研究，但多停留在初期研究阶段，因此，进一步深入探索和开发便捷、特异有效、能够在临床推广应用的甲基化诊断试剂盒具有重要的临床意义。

发明内容

本发明针对早期结直肠癌诊断技术存在的侵入性、价格昂贵、准确性低等技术问题提出一种无创的技术方案，该方案基于TRGV9、TRDJ3、TRDC、FAM174B、ZMIZ2多基因DNA甲基化水平的结直肠癌诊断试剂盒，该试剂盒具有较高的检测灵敏度和特异度，以期实现准确、快捷的诊断早期结直肠癌。

为了达到上述目的，本发明是采用下述的技术方案实现的：

一种基于外周血单个核细胞DNA的结直肠癌诊断检测的引物和探针，所述检测引物和探针用于检测结直肠癌特异性DNA甲基化标志物，所述结直肠癌特异性标志物包括：TRGV9、TRDJ3、TRDC、FAM174B、ZMIZ2基因。检测引物用于扩增所述结直肠癌特异性标志物的一段序列。

TRGV9扩增区域序列：

5’-GAATGAAAGTTTCCTCCTGTATGGCCTCTGTCCTTCTCACACAAGTTGGAAGGCCTTAGCCGTGAACTGAGCCTTCAGTAGAGGTTAGAGACGCTGGGCTGTTTCAGAAGCAAGGCGTAGCGTTTTTTTTTTTTATTTCTTGTTGCTCAGACTGGAGTGCAATGGCACGATCTCGGCTCACCACAACCCCTGCCTCCTGG-3’。

TRDJ3扩增区域序列：