[发明专利]一种用于结直肠癌诊断的多基因DNA甲基化联合检测试剂盒及应用

权利要求书

1.外周血单个核细胞中TRGV9、TRDJ3、TRDC、FAM174B、ZMIZ2基因在制备结直肠癌诊断试剂盒中的应用。

2.一种用于结直肠癌诊断的多基因DNA甲基化联合检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于检测TRGV9、TRDJ3、TRDC、FAM174B、ZMIZ2基因甲基化的引物对和基因特异的水解探针，

所述TRGV9基因检测正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

TRDJ3基因检测正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

TRDC基因检测正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

FAM174B基因检测正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；

ZMIZ2基因检测正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。

3.根据权利要求2所述用于结直肠癌诊断的多基因DNA甲基化联合检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括β-actin基因的PCR扩增特异性引物和探针，所述β-actin基因检测正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。

4.根据权利要求2所述用于结直肠癌诊断的多基因DNA甲基化联合检测试剂盒，其特征在于，所述特异性识别TRGV9、TRDJ3、TRDC、FAM174B、ZMIZ2基因甲基化的探针5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团；TRGV9、TRDJ3、TRDC基因探针5’端的荧光报告基团为FAM，FAM174B、ZMIZ2基因探针5’端的荧光报告基团为CY5，β-actin基因探针5’端的荧光报告基团为VIC，TRGV9、TRDJ3、TRDC、FAM174B、ZMIZ2及β-actin基因3’端荧光淬灭基团均为BHQ1。

5.根据权利要求2所述用于结直肠癌诊断的多基因DNA甲基化联合检测试剂盒，其特征在于，

试剂盒中的阴性质控品由β-actin基因非甲基化的人基因组DNA配制而成；阳性质控品由β-actin基因甲基化的人基因组DNA配制而成；阴性质控品无明显扩增曲线变化或Ct值≥35，阳性质控品的Ct值≤10，为有效实验；

还包括一个诊断模型，诊断模型公式如下：

△CT₁= CT_VIC-CT_FAM,

△CT₂= CT_VIC-CT_CY5，

Multi-PCR Score=1/[1+exp(10.73266+11.57596*△CT₁- 15.31471*△CT₂)]；

Multi-PCR Score大于0.5，结果为阴性；

Multi-PCR Score小于0.5，结果为阳性；

若VIC荧光通道的Ct值35或无扩增，ΔCt为任何结果皆为无效，需要重新提取转化样本后检测。