[发明专利]一种高效合成血红素的毕赤酵母重组菌株的构建

说明书

本发明公开了一种高效合成血红素的毕赤酵母重组菌株的构建，属于基因工程技术领域。本发明实现了血红素在毕赤酵母中的高效合成，首先构建得到血红素合成关键酶双截短菌株X33‑pGAPZA‑△ku70‑△70aaHem14‑△70aaHem15‑mScarlet，菌株在最优发酵时间48h下，添加终浓度为150mg/LALA和20mg/LFe²⁺发酵培养基中，血红素产量达到0.352mg/L，较对照提高了41.9％，说明将hem14与hem15基因截短后定位于细胞质，可以提高血红素合成下游途径的酶促反应速率，本发明有利于解除血红素合成空间隔离障碍，提高血红素产量，为促进肌红蛋白/血红蛋白在人造肉等食品加工领域的应用奠定了基础。

技术领域

本发明涉及一种高效合成血红素的毕赤酵母重组菌株的构建，属于基因工程技术领域。

背景技术

血红蛋白是自然界中普遍存在的血红素结合蛋白，在生物体中具有补铁、运输氧、呼吸等重要的生理功能，更赋予了肌肉组织鲜红的颜色。近年来，随着人造肉制品的兴起，为了模拟真肉的颜色和风味，需要在产品中添加血红蛋白。除此之外，肌红蛋白也被证实和真肉的肉色形成存在密切的关系。因此，随着在人造肉领域中越来越广泛的应用，国内外市场对肌红蛋白/血红蛋白的需求量也在不断增加。

无论是血红蛋白还是肌红蛋白都需要血红素作为辅基，所以必须增强胞内血红素的供应水平，以满足血红蛋白/肌红蛋白合成过程中对血红素辅基的需求。

血红素是由亚铁离子和原卟啉组成，血红素合成的关键前体是5-氨基乙酰丙酸(ALA)。ALA的合成在不同生物体中有着不同的途径，可以通过两种可行的合成途径(C4或C5途径)之一来积累。

在供应足量血红素前体ALA的基础上，目前已经可以利用不同的微生物发酵合成血红素。毕赤酵母与常见的细菌宿主大肠杆菌相比，具有完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰及分泌能力，被广泛应用于食品与制药领域。毕赤酵母表达合成系统是较早被开发的真核基因表达体系，目前已成功实现了动植物、细菌、病毒、真菌等外源基因的表达。因此，应用毕赤酵母表达系统来合成血红素是最佳的选择。

目前，已鉴定所有血红素合成关键酶的胞内定位(Hem1-线粒体，Hem2-细胞质，Hem3-细胞质，Hem4-细胞质，Hem12-细胞质，Hem13-细胞质，Hem14-线粒体，Hem15-线粒体)。尚无通过将定位于线粒体中的血红素合成相关酶hem14和hem15基因截短，重新定位于细胞质，解除血红素合成过程中的空间隔离障碍，来提高血红素合成水平的报道。

发明内容

针对目前存在的问题，本发明首先在毕赤酵母中尝试表达截短碳端多个氨基酸的血红素合成关键酶基因(hem14和hem15)；然后对表达截短的血红素合成关键酶的菌株进行荧光蛋白亚细胞定位，通过摇瓶发酵检测血红素，产量提高说明将Hem14与Hem15截短后定位于细胞质，可以提高血红素合成下游途径的酶促反应速率，体现本策略的有效性。

本发明的第一个目的是提供一种重组菌，所述重组菌利用毕赤酵母表达碳端截短70个氨基酸的血红素合成关键酶基因△70hem14和/或△70hem15。

在一种实施方式中，所述截短是将血红素合成关键酶碳端的第2-71个氨基酸进行截短。

在一种实施方式中，所述重组菌还抑制了毕赤酵母基因组中ku70基因的表达。

在一种实施方式中，通过基因敲除技术抑制毕赤酵母基因组中ku70基因的表达。

在一种实施方式中，所述ku70基因的GeneID:8199462。

在一种实施方式中，所述△70hem14的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述△70hem15的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。