[发明专利]检测β-半乳糖苷酶的黄酮衍生物荧光探针及其制备方法和应用、试剂盒及其使用方法

说明书

提出了一种检测β‑半乳糖苷酶的黄酮衍生物荧光探针及其制备方法和应用、试剂盒及其使用方法，本荧光探针以黄酮衍生物作为荧光团，通过β‑半乳糖苷酶选择性脱去荧光探针上的半乳糖基团来实现对β‑半乳糖苷酶的荧光检测。该荧光探针合成简单、且具有光稳定性好，无毒，水溶性强，生物相容性好的优点。探针本身无荧光，当识别基团与β‑半乳糖苷酶作用后，在612nm左右发射出橙红色荧光，且随着β‑半乳糖苷酶量的增加，荧光逐渐增强。因此本发明提供的β‑半乳糖苷酶探针及其专用检测试剂盒对β‑半乳糖苷酶有良好的响应，且具有操作简便，成本低廉，响应灵敏，易于推广和应用等优点，可用于食品、生物、化工、医药等领域中β‑半乳糖苷酶的定量分析。

技术领域

本发明涉及一种检测β-半乳糖苷酶的黄酮衍生物荧光探针及其制备方法和应用、试剂盒及其使用方法，属于荧光探针技术领域。

背景技术

β-半乳糖苷酶(β-Galactosidase，β-gal)是生物体内一种由β-半乳糖苷酶基因(lacZ基因)编码的水解酶，能够将一分子乳糖水解成一分子葡萄糖和一分子半乳糖，具有多种生理和病理功能。例如，大量研究证明β-gal是原发性卵巢癌和细胞衰老的重要生物标志物。因此，开发一种检测细胞或组织中β-gal的活性对生物医学和疾病诊断具有非常重要的意义。

目前，已有多种方法用于检测β-gal活性，包括核磁技术、比色法等。其中，比色法是使用最广的方法之一，也已有商业化试剂盒面世。其原理为β-gal会将催化无色的ONPG(ο-nitro-phenyl-β-D-galactopyranoside，2-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷)转变成黄色产物，从而通过对样品在405～430nm范围波长下的吸光度的测定，获得β-gal的相对活性。但是此方法操作复杂而且定量测试准确度较差。与之相比，荧光探针由于其操作简单、成本廉价、灵敏度高、选择性好，特别是对活细胞或组织中靶向生物分子的无损成像能力等优点，已成为生物科学中广泛应用的最强大工具之一。

截止目前，已有一些商业化的荧光探针，如Amplite^TMFluorimetric Beta-Galactosidase Assay Kit*Green Fluorescence*，MUGβ-GalactosidaseAssay Kit*Fluorimetric*等，然而由于合成复杂，因此售价较高，同时还存在水溶性差、发射波长短(如Amplite^TMFluorimetric Beta-Galactosidase Assay Kit最大发射波长为525nm)等问题，这会导致探针的组织穿透力低、背景荧光强，这些都限制了其在活体细胞或组织中的应用。因此，本领域急需发展合成简单、成本低廉、抗干扰能力强、准确度高、水溶性强且发射波长较长的荧光探针以用于细胞或组织中β-gal的检测。

发明内容

本发明针对当前检测β-半乳糖苷酶的荧光探针效果不佳的问题，提出了一种检测β-半乳糖苷酶的黄酮衍生物荧光探针及其制备方法和应用、试剂盒及其使用方法，以黄酮衍生物作为荧光团，通过β-半乳糖苷酶选择性脱去荧光探针上的半乳糖基团来实现对β-半乳糖苷酶的荧光检测。

本发明为解决上述问题所采用的技术手段为：一种检测β-半乳糖苷酶的黄酮衍生物荧光探针，其具有以下结构式：

一种检测β-半乳糖苷酶的黄酮衍生物荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

(1)将EPC、2-羟基苯乙酮和氢氧化钾溶于溶剂中，回流反应至结束，浓缩后柱层析纯化，得到深红色固体EPH：

其中溶剂可为甲醇或乙醇，上式中采用甲醇示出，且EPC、2-羟基苯乙酮和氢氧化钾的摩尔比优选为1:1.75：2.25～1:2:2.5，每1mmol的EPC优选使用1.5～2mL的溶剂；