[发明专利]一种蝎毒素来源的穿膜多肽的制备方法及应用

说明书

本发明涉及生物医药工程技术领域，提供了一种蝎毒素来源的穿膜多肽的制备方法及应用。本发明通过截短的方式对OpiCalcin1多肽进行优化，提供了两条穿膜功能优异且细胞毒性较低的多肽Opi1 17‑33 CSKKCKRRGTNPEKRCR和Opi1 23‑33 RRGTNPEKRCR。通过实验验证，该两条细胞穿膜肽穿膜效果优异且细胞毒性低，同时也克服了合成蝎毒素OpiCalcin1完整序列费时费力的缺陷，可用于制备药物、核定位序列以及探针等的转运载体，提高靶向效率。与传统的以蝎毒入药相比，针对蝎毒素进行合成来探索其穿膜活性，为药物载体提供了一种新的选择。

技术领域

本发明涉及生物医药工程技术领域，具体涉及一种细胞穿膜肽及其应用。

背景技术

蝎子又称为全蝎，为治风要药，具有息风镇痉、通络止痛、攻毒散结的功效，在典籍记载中，蝎子常以全蝎入药，但蝎子的药用价值主要在它的药理毒素成分。蝎毒中的活性成分主要由蛋白质成分和非蛋白质成分两部分组成，其中非蛋白质成分中主要含有粘多糖、组织胺、5-羟色胺、有机酸及微量元素等，而发挥主要功能作用的蛋白质成分则主要由小分子多肽组成，这些小分子多肽通常被称为蝎毒素，它们往往由20-80个氨基酸组成，在组成蝎毒素的这些氨基酸中又含有数个半胱氨酸，这些半胱氨酸可相互作用形成多个二硫键，这样的结构可以发挥蝎毒多肽的生物功能以及提高其稳定性。

目前所发现的蝎毒多肽已有300种，这些蝎毒多肽为离子通道抑制剂，其具有抗癫痫、抗血栓、抗肿瘤、镇痛等生物活性。除此以外，部分蝎毒多肽还具有细胞穿膜肽的特点，可以作为细胞穿膜肽的蝎毒素的氨基酸序列中往往会含有大量的精氨酸或赖氨酸等碱性基团，具有此特点的蝎毒素可以透过细胞膜进入细胞内发挥生物活性。

OpiCalcin1是一类从蝎子中分离得到的一种由33个氨基酸残基组成的具有细胞穿膜功能的肽类毒素，该肽由Cys3-Cys17，Cys10-Cys21和Cys16-Cys32三对二硫键构成，经过1HNMR测定发现，OpiCalcin1中含有一个半胱氨酸结的ICK基序和三条β链。OpiCalcin1是一个碱性多肽，在组成OpiCalcin1的33个氨基酸中，有11个氨基酸残基带有正电荷，有4个氨基酸残基带有负电荷，整条OpiCalcin1链的净电荷为正电荷；另外OpiCalcin1还是一条亲水性多肽，在全部的33个氨基酸残基中，极性氨基酸残基所占比例为58％。

本研究主要围绕蝎毒素OpiCalcin1系列多肽进行合成、纯化以及穿膜活性分析，以在之前的研究基础上进行进一步的功能探究，以将蝎毒素OpiCalcin1进行老药新用，发挥其新的药用价值。

发明内容

本发明依托上述研究进行，通过化学合成法合成了蝎毒素OpiCalcin1(简称Opi1)不同片段，并用异硫氰酸荧光素对其进行荧光标记，探究了蝎毒素Opi1系列穿膜肽的穿膜效果，在与TAT进行比对后发现了一种穿膜效果更好且毒性更小的细胞穿膜肽Opi1 17-33及Opi1 23-33，此细胞穿膜肽有望成为一种新型的细胞穿膜肽，为药物载体提供一种新的选择。

本发明的第一目的在于以截短的方式对OpiCalcin1多肽进行优化，提供了两条穿膜功能优异且细胞毒性较低的多肽Opi1 17-33 CSKKCKRRGTNPEKRCR和Opi1 23-33RRGTNPEKRCR。

本发明通过对蝎毒素OpiCalcin1的完整序列进行分析，并根据序列长度或碱基基序将其划分为：Opi1 1-16、Opi1 17-33、Opi1 1-11、Opi1 12-22、Opi1 23-33、FITC-Opi13-11、FITC-Opi1 16-24、FITC-Opi1 25-33这八部分，然后以成熟的细胞穿膜肽TAT作为阳性对照多肽。各肽段及阳性对照多肽的氨基酸序列及分子量如下表1所示：

表1不同OpiCalcin1肽段序列