[发明专利]一种蝎毒素来源的穿膜多肽的制备方法及应用

权利要求书

1.一种细胞穿膜肽，其特征在于，该细胞穿膜肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ IDNO.2所示。

2.权利要求1所述的细胞穿膜肽的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：

A、Fmoc固相合成法合成肽段

以氨基树脂或wang树脂为固相载体，选用Oxyma为活化剂，以DIC为缩合剂，在60±10℃条件下使氨基酸之间发生缩合反应；然后用茚三酮检测试剂来判断缩合反应是否反应完全；反应完全后，末端连接一个连接基团，以使荧光素与多肽进行连接，

B、荧光标记

连接基团脱Fmoc保护后，依次添加过量当量的荧光素和反应试剂进行荧光素标记；而后采用TFA、苯酚、水以及TIPS组成的切割液，将目标肽链与固相树脂载体分离，沉淀处理后完成粗品多肽，

C、纯化及分析

将粗品多肽用一定比例的水和乙腈进行溶解，滤膜过滤后，取部分滤液进行LC-MS分析，确定目标肽段的出峰位置和验证目标肽段的分子量。

3.根据权利要求2所述的细胞穿膜肽的合成方法，其特征在于：

其中，步骤A包括如下子步骤：

1)树脂准备与溶胀：称取取代值为0.43mmol/g、带有Fmoc保护基的RinkAmide Resin，按照质量体积比15～16:1加入二氯甲烷，静置使其充分溶胀，待溶胀结束后将二氯甲烷抽掉，并用DMF将其冲洗多遍；

2)脱Fmoc保护：加入20％哌啶及7.1％Oxyma或DMF溶剂组成的脱保护混合试剂进行脱保护，第一次在接肽管中加入脱保护混合试剂，置于35±5℃气浴恒温振荡器中振摇，反应结束后抽干，再次加入脱保护混合试剂，以同样条件振荡；脱保护结束后用DCM和DMF依次对其清洗3～5遍，之后取出部分树脂进行茚三酮检验，水浴加热后若树脂变为蓝紫色，则代表脱保护成功；

3)C端连接第一个氨基酸：称取C端第一个氨基酸，加入活化剂Oxyma，用NMP进行充分溶解后加入DIC再次进行混匀，氨基酸活化时间不超过2min，将活化后的氨基酸后加入放有树脂的接肽管中，在60±10℃，60±10RPM的条件下反应20±10min，使氨基酸与树脂进行缩合反应；缩合反应结束后用DCM及DMF依次清洗3～5遍，之后用毛细管蘸取少量数值加入茚三酮检测试剂进行检测，观察是否反应完全；

4)脱Fmoc保护：连完C端第一个氨基酸后，需要脱掉第一个氨基酸上氨基的Fmoc保护基以使氨基酸与下一个氨基酸进行连接，反应条件同步骤2)；

5)第一个氨基酸脱保护之后再对第二个氨基酸进行活化，活化步骤按照第一个氨基酸的步骤进行，并将活化后的氨基酸投入到接肽管中，使第二个氨基酸与第一个氨基酸进行缩合反应，反应结束后进行茚三酮检测，连接成功后对其进行脱Fmoc保护，并继续活化下一个氨基酸，操作步骤与前一个氨基酸一致，直至完成最后一个氨基酸的连接；

6)Linker连接：选用芴甲氧羰基-6-氨基己酸作为连接基团对FITC荧光素进行连接；对最后一个氨基酸进行脱保护之后，依次加入芴甲氧羰基-6-氨基己酸及活化剂Oxyma，用NMP进行充分溶解后加入DIC再次进行混匀进行连接基团活化；将活化后的ACP加入放有树脂的接肽管中，在60±10℃，60±10RPM的条件下反应20±10min，使连接基团与肽链进行连接，连接结束后用DCM和DMF对肽链依次冲洗3～5遍，然后用茚三酮进行检测，看其是否反应完全。