[发明专利]一种抗破伤风单克隆抗体组合物的制备方法及应用

说明书

本发明涉及生物免疫学技术领域，具体地说是一种抗破伤风单克隆抗体组合物的制备方法及应用。一种抗破伤风单克隆抗体组合物，其特征在于：所述的组合物包括：4株单克隆抗体，所述的4株单克隆抗体名称分别为S3A4、9‑7A4、9‑8C7、S1D2，并且每株克隆抗体分别由轻链及重链组合。同现有技术相比，提供一种抗破伤风单克隆抗体组合物的制备方法及应用，利用破伤风类毒素免疫小鼠，获得了4株具有协同保护作用的单克隆抗体，并进一步对其结合片段的定位。并进行人源化且重组表达后，其协同中和保护作用的效价可达70IU/mg。

技术领域

本发明涉及生物免疫学技术领域，具体地说是一种抗破伤风单克隆抗体组合物的制备方法及应用。

背景技术

破伤风是由破伤风杆菌入侵创伤而引起的一种特异性感染，其主要致病原是破伤风杆菌产生的破伤风类毒素。破伤风类毒素是一个由1315个氨基酸组成的分子量约为150kDa蛋白。该多肽在破伤风杆菌的蛋白水解酶作用后，在456和467氨基酸残基之间裂解成为分量大约为50KD轻链(LC)和100KD重链(LN)，LC和LN通过一对二硫键S439-S467连接。LC是锌依赖蛋白酶，在193-197位有一个锌指结合蛋白的功能域HELIH，375位的酪氨酸是一个催化活性位点。在864和863之间有一个木瓜蛋白酶(papin)切位点可以将重链进一步降解为N端(HCN)和C端(HCC或TTC)。HCN负责突触囊泡通过细胞质进入细胞质的膜，而TTC负责毒素结合神经元细胞。当TTC结合神经元上神经节苷脂受体后，在HCN协助下，LC进入神经元后被运输到神经元胞质，在那里裂解可溶性NSF黏附蛋白(solubleNSFattachmentprotein(SNAP)eceptor(SNARE)proteins)，通过水解突触囊泡蛋白Ⅱ而阻断神经抑制性介质的释放，阻断了神经元和运动神经元之间的信号传递，从而产生了破伤风特有的痉挛性瘫痪特征。表现为全身骨骼肌持续性强直和阵发性痉挛，重症患者可发生喉痉挛、窒息、肺部感染和器官功能衰竭，是一种极为严重的潜在致命性疾病。

目前对破伤风的认识是防重于治。破伤风在当下的预防措施包括注射破伤风类毒素主动免疫，正确处理伤口，以及在伤后采用被动免疫预防发病。最有效的方法是注射破伤风抗毒素(TAT)、马破伤风免疫球蛋白F(ab’)2或人破伤风免疫球蛋白(TIG)。破伤风抗毒素(TAT)和马破伤风免疫球蛋白均是用破伤风类毒素免疫马匹所制得的抗毒素，其形式有所差异的，这两种形式的抗毒素来源于马匹，有一定程度过敏反应，而人破伤风免疫球蛋白(TIG)是破伤风类毒素免疫人体所制得的抗毒素，虽然无过敏性但具有较昂贵、来源少、制备复杂、供应不足等等缺点。我国临床上广泛使用的仍为TAT，只有在TAT过敏试验阳性或者家属主动要求的情况下才会使用TIG。因此，人们希望找到一种低过敏性且价格低廉的抗体，可以替代目前的抗体来源。

随着杂交瘤单克隆技术和噬菌体展示技术以来，人们逐渐在该领域中使用这些技术进行研究，但是这些研究仍存在的一些问题：①有的文章未报到筛选到单克隆抗体或者未测序；②筛选到的序列未进行克隆表达，仅做了序列分析；③克隆表达的序列仅仅进行了体外ELLISA和(或)体外结合实验，未知体内的保护作用；④有的序列表达后进行了小鼠体内中和保护实验，但没有或者很弱的协同保护作用。一种常见的思路就是多种单抗混合类似“鸡尾酒”方式，这种思路方案有两种方案，一是分别表达单抗，再混合；一是混合表达单抗。

发明内容

本发明为克服现有技术的不足，提供一种抗破伤风单克隆抗体组合物的制备方法及应用，利用破伤风类毒素免疫小鼠，获得了4株具有协同保护作用的单克隆抗体，并进一步对其结合片段的定位。并进行人源化且重组表达后，其协同中和保护作用的效价可达70IU/mg。

为实现上述目的，设计一种抗破伤风单克隆抗体组合物，其特征在于：所述的组合物包括：4株单克隆抗体，所述的4株单克隆抗体名称分别为S3A4、9-7A4、9-8C7、S1D2，并且每株克隆抗体分别由轻链及重链组合。