[发明专利]一种抗破伤风单克隆抗体组合物的制备方法及应用

权利要求书

1.一种抗破伤风单克隆抗体组合物，其特征在于：所述的组合物包括：4株单克隆抗体，所述的4株单克隆抗体名称分别为S3A4、9-7A4、9-8C7、S1D2，并且每株克隆抗体分别由轻链及重链组合。

2.根据权利要求1所述的一种抗破伤风单克隆抗体组合物，其特征在于：所述的S3A4单克隆抗体的轻链核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，S3A4单克隆抗体的轻链核苷酸编码蛋白序列如SEQ ID NO：2所示；S3A4单克隆抗体的重链核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，S3A4单克隆抗体的重链核苷酸编码蛋白序列如SEQ ID NO：4所示。

3.根据权利要求1所述的一种抗破伤风单克隆抗体组合物，其特征在于：所述的S1D2单克隆抗体的轻链核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，S1D2单克隆抗体的轻链核苷酸编码蛋白序列如SEQ ID NO：6所示；S1D2单克隆抗体的重链核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，S1D2单克隆抗体的重链核苷酸编码蛋白序列如SEQ ID NO：8所示。

4.根据权利要求1所述的一种抗破伤风单克隆抗体组合物，其特征在于：所述的9-7A4单克隆抗体的轻链核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，9-7A4单克隆抗体的轻链核苷酸编码蛋白序列如SEQ ID NO：10所示；9-7A4单克隆抗体的重链核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示，9-7A4单克隆抗体的重链核苷酸编码蛋白序列如SEQ ID NO：12所示。

5.根据权利要求1所述的一种抗破伤风单克隆抗体组合物，其特征在于：所述的9-8C7单克隆抗体的轻链核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示，9-8C7单克隆抗体的轻链核苷酸编码蛋白序列如SEQ ID NO：14所示；9-8C7单克隆抗体的重链核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示，9-8C7单克隆抗体的重链核苷酸编码蛋白序列如SEQ ID NO：16所示。

6.一种根据权利要求1至5所述的抗破伤风单克隆抗体组合物的制备方法，其特征在于：具体流程如下：

S1，第一次免疫：将20ug的抗原与200ul的完全弗氏佐剂混匀，配置成400ul的溶液，注射于小鼠皮下多点；

S2，第2~5次免疫：距上次免疫间隔两周后，将20ug的抗原与200ul的不完全弗氏佐剂混匀，配置成400ul溶液，注射于Ba1b/c 小鼠皮下多点；并在第4次免疫后小鼠尾静脉采血，待血清滴度 105以上；

S3，加强免疫：在小鼠尾静脉注射抗原20ug；

S4，取免疫小鼠，放血，断颈猝死，在75% 的酒精中浸泡3~4min，无菌条件下取出小鼠脾脏，放入15ml的离心管中，加入少许无血清RPM 1640的培养液，用移液管轻轻吹打，碾碎，直至没有组织结块、细胞均匀为止；

S5，用无血清RPM 1640的培养液洗涤小鼠脾脏细胞三次；

S6，取对数生长期的Sp2/0-Ag14的小鼠骨髓瘤细胞，在无血清RPM 1640的培养液洗涤三次；

S7，将小鼠脾脏细胞和Sp2/0-Ag14的小鼠骨髓瘤细胞以10:1的比例混合，1500rpm 离心7min，洗去上清液；

S8，在1min内缓缓加入1m1的PEG，轻摇90s，再在2.5min 中内加入5ml的无血清RPM1640的培养液，最后再加入5m1的无血清培液终止反应，静置5min 后，1280rpm 离心8min，弃去上请，加入常规RPM 1640的培养液(含有10% 胎牛血清)，制备成细胞悬液；

S9，将上述细胞悬液以每孔2x104个细胞的密度种入96孔板，每孔200ul，置于370C、5%CO2 细胞培养箱中孵育，培养24h后，更换含有HAT (25 X) 的常规RPM 1640培养液，在370C、5% CO2细胞培养箱中继续孵育，培养14d后，稀释倍数小于100倍且其OD450大于1者被用于进一步筛选；

S10，经筛选，获得4株单克隆抗体，分别命名为S3A4、9-7A4、9-8C7和S1D2，它们的中和效价分别为52IU/ml、53IU/ml、58IU/ml和60IU/ml；

S11，用ELISA叠加法确定4株单克隆抗体的协同性；

S12，从4株单克隆抗体中提取总RNA，并获得4株单克隆抗体的可变区编码序列；

S13，将4株单克隆抗体中随机抽取2株单克隆抗体，对其轻链核苷酸序列和重链核苷酸序列分别进行人源化操作，获得轻链V区蛋白序列和重链V区蛋白序列；

S16，将鼠kappa链的前导肽序列氨基酸序列、人的kappa链恒定区和轻链V区蛋白序列串联、优化后，获得zumb轻链的核苷酸；

S17，将鼠kappa链的前导肽序列氨基酸序列、人的IgG1恒定区蛋白序列和重链V区蛋白序列串联、优化后，获得zumb重链的核苷酸；

S18，将步骤S16及S17获得的zumb轻链的核苷酸和zumb重链的核苷酸进行基因合成，同时亚克隆到载体pCDNA3.1（+）中，获得单克隆抗体组合物；

S19，将单克隆抗体组合物进行蛋白表达稳定株建立；

S20，将蛋白表达稳定株建立后的单克隆抗体组合物进行纯化处理，最终获得安全有效量的抗破伤风单克隆抗体组合物。