[发明专利]一种基于固相载体的DNA分子信号扩增及核酸测序的方法

说明书

本发明公开了一种基于固相载体的DNA分子信号扩增及核酸测序的方法。所述方法包括：通过羧基与氨基的缩合反应，将羧基化的DNA引物固定于表面氨基化的固相载体上，向所述固相载体上加入环状DNA文库和扩增试剂，进行滚环扩增，所述DNA引物与所述环状DNA文库通过碱基互补的方式结合。本发明将DNA引物固定于固相载体上，利用滚环扩增将DNA扩增成线性的螺旋结构，避免了由于桥式PCR扩增成cluster引起的错误累积，提高测序准确性，亦降低因桥式PCR引起的较高duplicate比率，节约测序成本，同时，进行等温DNA扩增，对设备要求低，可减少操作人员负担，实现自动化制备。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种基于固相载体的DNA分子信号扩增及核酸测序的方法。

背景技术

高通量测序技术(High-throughput sequencing)又称“下一代”测序技术(Next-generationsequencing technology)，以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。高通量测序的步骤包括样品准备，文库构建，测序反应和数据分析，高通量测序的文库构建阶段，可以通过PCR将文库模版扩增数千倍，从而达到上机的文库量，以便完成后续对基因组DNA序列的测定；在测序阶段，单个DNA分子的信号难以检测，需要通过扩增使单个DNA分子形成一簇(即cluster)或成球(DNB)，获得足够强度的信号，测序才能够检测到，对于核酸模板而言，有的二级结构复杂，有的热稳定性不好，这些因素都会影响PCR扩增效率。

目前市场在测序阶段进行DNA分子信号扩增的方式有通过扩增使单个DNA分子形成一簇，即cluster。桥式PCR扩增形成cluster这一过程的错误累积会降低DNA序列复制的保真性，影响低深度测序变异和低频突变检测的精准度和敏感度。由于建库和测序的PCR扩增，会带来较高的duplicate比率，造成DNA数据量浪费，从而增加测序成本。进行RNA测序时，因为难以区分是PCR duplicates还是RNA高表达形成的相同的模板，则无法去除duplicates，这将会影响转录组表达量的准确性，尤其是小、中等表达量的转录本的准确性。

另一种在测序阶段获得足够强度的信号的方式是通过扩增使单个DNA分子形成DNA纳米球，如CN113774120A公开一种DNB双末端测序方法，其过程是先在PCR仪中进行扩增，对DNA纳米球进行定量，最后将DNA纳米球载入芯片中并通过一定方式将DNB固定在芯片中，该过程工艺繁琐，需要额外增加PCR仪和DNA纳米球定量设备，制备时间长，自动化程度低。

综上所述，如何提供一种高效扩增DNA分子信号的方法，有效避免错误积累及降低成本，是基因测序领域亟待解决的问题之一。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种基于固相载体的DNA分子信号扩增及核酸测序的方法，能够高效、低成本地对测序过程中DNA分子信号进行扩增，同时提高测序准确性。

为达上述目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种基于固相载体的DNA分子信号扩增方法，所述方法包括：

通过羧基与氨基的缩合反应，将羧基化的DNA引物固定于表面氨基化的固相载体上，加入环状DNA文库和扩增试剂，进行滚环扩增，所述DNA引物与所述环状DNA文库通过碱基互补的方式结合。

本发明中，通过羧基与氨基的缩合反应将含有羧基的DNA引物固定于表面含有氨基的固相载体上，能够得到高效负载DNA引物的固相载体，随后环化的文库与DNA引物通过碱基互补的方式结合并固定在固相载体上，文库在酶和试剂的作用下进行滚环扩增，扩增成线性的螺旋结构，可避免桥式PCR错误累积，同时对设备要求低，不过度依赖PCR仪等设备，易于操作，可实现自动化制备，对于基因高通量测序领域具有重要意义。

优选地，所述固相载体的材质包括玻璃、硅胶、陶瓷、塑料或金属中的任意一种。