[发明专利]一种还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法

说明书

本发明涉及工业催化技术领域，尤其是一种还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法，包括以下步骤：1)高温条件下甲酸脱氢酶活性的筛选；2)酸性条件下甲酸脱氢酶活性的筛选；3)根据步骤(1)和步骤(2)的结果，选择在高温条件和酸性条件下同时具有较高活性的甲酸脱氢酶待用；分别称取甲酸铵、NAD至烧瓶中，加纯水，在水浴中搅拌溶解并使用氢氧化钠调节pH为酸性；最后加入筛选得到的甲酸脱氢酶开始反应，并用氢氧化钠维持pH为酸性，制得还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。本方法可以使得反应能够在短时间内完成，既避免了酸性条件下产物的水解，又避免了碱性条件下生成的碳酸盐；完成反应后无大量碳酸盐，纯化成本低。

技术领域

本发明涉及工业催化技术领域，具体领域为一种还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备 方法。

背景技术

还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)是多种氧化还原酶的辅酶，在工业催化上具有 重要作用，并且近年来研究人员发现NADH还具有多种人体保健功能，可能是潜在的保肝护肝及解酒保健品/药物。

NADH主流的生产方法是通过从酵母中提取NAD并还原为NADH来制备的。目前已 有许多将NAD还原为NADH的酶促方法，例如使用醇脱氢酶、甲酸脱氢酶、葡萄糖脱氢 酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶等，但不同的制备工艺对产品的纯化影响较大。

目前，NADH的生产主要是用乙醇脱氢酶和乙醇。为此，需要使用过量的乙醇，并不断去除产生的挥发性乙醛。这种方法的优点是使用了廉价的乙醇和可从酿酒酵母中大量获得的乙醇脱氢酶；但弊端是NADH转化不完全，且在反应中产生了有毒的乙醛。

而甲酸铵工艺则具有乙醇工艺不可比拟的优势。专利DE10254995、EP1424399等文献中公开的制备NADH和NADPH的方法，是将甲酸、碱金属和甲酸脱氢酶一起孵育并去 除大部分形成的碳酸盐，酶促制备还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或其磷酸盐，并用到了至 少一种碱金属甲酸盐，最终消除形成的碱金属碳酸盐。尽管这些碳酸盐具有稳定NADH的 优点，但它们也具有难以与NADH分离并且混入水和乙醇而导致大量干燥NADH时出现 问题的缺点。专利DE10254995、EP1424399的方法最终会有0.5％至5％的碱金属碳酸盐保 留在反应溶液中，并带至最终的产品中，这在一些国家做为保健品或功能性食品应用是不 被法规允许的。

另外，现有的甲酸铵工艺还存在自身的缺陷。7.5-8.5的pH值对甲酸脱氢酶的最大酶 活性发挥是有利的，且对于稳定生产所得的NADH也是有益的。但是，甲酸脱氢酶还原NAD会产生二氧化碳，二氧化碳只在酸性至中性pH下从反应混合物中逸出，而在碱性溶 液中易形成碳酸盐不利于后处理提纯。

因此，本发明试图寻找一种方案来解决上述矛盾，既可以让二氧化碳易于溢出而少残 余碳酸盐，又可让甲酸脱氢酶发挥最大酶活并确保产物NADH的稳定。

发明内容

本发明的目的在于提供一种还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法，包括以下步骤：

由于普通的Candida boidinii甲酸脱氢酶最大酶活区间在60℃左右，但该酶超过40℃ 会快速失活，故实际应用中反应温度通常设定在25-30℃；反应pH通常在7.5-8.5，过高过 低都会影响酶活。而这两个条件都不利于本发明的设计思路实施，故需要先筛选适合本发 明的甲酸脱氢酶。

(1)高温条件下甲酸脱氢酶活性的筛选

将若干种甲酸脱氢酶干粉分别按适当的比例稀释后(通常按质量稀释100-500倍)， 各取500μl加入48℃水浴锅中温育15分钟，对甲酸脱氢酶的活力进行测定，根据测定结 果筛选得到高温条件下具有较高活性的甲酸脱氢酶；

(2)酸性条件下甲酸脱氢酶活性的筛选