[发明专利]基于一代测序技术直接检测KLF1基因启动子区CpG甲基化的方法和试剂盒

说明书

本发明提供一种基于一代测序技术直接检测KLF1基因启动子区CpG甲基化的方法和试剂盒，包括检测引物对、步骤方法和检测试剂；所述检测引物对包括用于检测KLF1基因上游CpG甲基化的扩增引物对和测序引物；所述方法为用重亚硫酸盐处理待测样本基因组DNA后通过巢式PCR扩增，然后产物进行一代测序，最后用序列分析软件对测序峰图CpG位点C/（C+T）峰面积比值进行分析，从而得到该位点的甲基化状态；所述检测试剂包括阴性对照和PCR反应液。应用本发明试剂盒来检测KLF1基因上游CpG甲基化状态可作为研究血红蛋白珠蛋白调控研究的有力手段，操作简便，检测周期短，具有较高的稳定性和特异性。

技术领域

本发明涉及生物医学检测技术，具体涉及一种基于一代测序技术检测KLF1基因启动子区CpG甲基化的方法和试剂盒。

背景技术

KLF1基因是重要的红系转录因子，它在红细胞生成过程中主要有三大功能：（a）在巨核系/红系祖细胞阶段，KLF1的表达能促进细胞向红系分化；(b)在终末分化的成熟红细胞晚期，KLF1起阻滞细胞周期的作用；(c)在整个红系发育过程中KLF1基因持续表达，并作为一个重要的因子直接参与调控了胎儿血红蛋白Hb F向成人血红蛋白Hb A转化过程。KLF1基因主要以下述两种方式实现珠蛋白转换。一方面，在成人时期它可通过结合BCL11A基因启动子区域的特异性序列（CACCC）直接正向调节BCL11A基因的表达，促进BCL11A因子及其他伴侣分子（如GATA1、FOG和NuRD等）结合成转录复合体来抑制γ珠蛋白基因的表达，使胎儿血红蛋白Hb F表达关闭；另一方面，KLF1基因编码产物可结合在β珠蛋白基因的启动子上直接激活其表达，使其Hb A表达开放，从而构成了Hb F/Hb A表达转换的基本调节通路。研究表明，KLF1基因是β地中海贫血的修饰基因，KLF1的剂量效应不足可缓解β地中海贫血的临床表型严重性。此外，KLF1在造血组织中特异性表达与KLF1基因上游CpG位点的甲基化修饰程度相关，且其表达量高低与甲基化程度呈负性相关，因此研究不同组织细胞、不同发育阶段或不同血液病患者中KLF1基因上游CpG位点的甲基化程度具有重要意义。KLF1基因启动子区有2个CpG位点相对密集区域，共13个CpG位点（+20，+11，-18，-83，-86，-119，-387，-398，-410，-419，-445，-497，-541）为本发明所检测位点。

重亚硫酸盐能使DNA中未经甲基化修饰的胞嘧啶（C）脱氨基转变成尿嘧啶（U），而甲基化修饰的胞嘧啶保持不变，经PCR扩增后片段中的尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶（T）。结果使完全不甲基化的CpG位点为TG，部分甲基化的位点为TG/CG杂合，完全甲基化的位点不变仍为CpG。最后，PCR产物经一代测序（Sanger测序）后比较CpG中胞嘧啶所在位点的C与T峰面积比值即可定量CpG甲基化程度。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明提供基于一代测序技术直接检测KLF1基因启动子区CpG甲基化的方法和试剂盒。

为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案。

本发明提供一种基于一代测序技术直接检测KLF1基因启动子区CpG甲基化的PCR引物组，其特征在于，所述引物组包括扩增引物和测序引物。

进一步地，所述扩增引物的序列如下所示：

（1）巢式PCR第一轮两段扩增子的上下游引物分别为：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；

（2）巢式PCR第二轮两段扩增子上下游引物分别为：；SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:4。

进一步地，所述测序引物的序列包括：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5。

本发明还提供一种基于一代测序技术直接检测KLF1基因启动子区CpG甲基化的检测反应体系，其特征在于，所述反应体系含有权利要求1-2任一项所述的一组或几组的PCR引物组。