[发明专利]基于一代测序技术直接检测KLF1基因启动子区CpG甲基化的方法和试剂盒

权利要求书

1.一种基于一代测序技术直接检测KLF1基因启动子区CpG甲基化的PCR引物组，其特征在于，所述引物组包括扩增引物和测序引物。

2.根据权利要求1所诉的一种基于一代测序技术直接检测KLF1基因启动子区CpG甲基化的PCR引物组，其特征在于，所述扩增引物的序列如下所示：

（1）巢式PCR第一轮两段扩增子的上下游引物分别为：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2；SEQID NO:3和SEQ ID NO:4；

（2）巢式PCR第二轮两段扩增子上下游引物分别为：；SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:6；SEQID NO:5和SEQ ID NO:4。

3.根据权利要求1所诉的一种基于一代测序技术直接检测KLF1基因启动子区CpG甲基化的PCR引物组，其特征在于，所述测序引物的序列包括：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4和SEQID NO:5。

4.一种基于一代测序技术直接检测KLF1基因启动子区CpG甲基化的检测反应体系，其特征在于，所述反应体系含有权利要求1-2任一项所述的一组或几组的PCR引物组。

5.根据权利要求4所述的检测反应体系，其特征在于，所述反应体系还包括硫化修饰后的DNA、PCR缓冲液、dNTPs、HiFi酶、去离子水和DMSO；所述dNTPs混合物包括dATP、dTTP、dGTP和dCTP。

6.一种基于一代测序技术直接检测KLF1基因启动子区CpG甲基化的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1-2任一项所述的一组或几组的PCR引物组。

7.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含权利要求5所述的检测反应体系。

8.一种基于一代测序技术直接检测KLF1基因启动子区CpG甲基化的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：

（1）待测样本DNA准备：采集被检测者外周血标本，采用柱式法提取样本DNA；

（2）巢式PCR反应体系：

第一轮PCR反应体系包括：10×LA Buffer 1.0μl，2.5nM dNTPs 0.8μl，5U/μlHiFi酶0.1μl，正向引物0.4μl，反向引物0.4μl，硫化修饰后的DNA2.5μl，去离子水4.8μl；

第二轮PCR反应体系包括：10×LA Buffer 2.5μl，2.5nM dNTPs 2μl，5U/μlHiFi酶0.2μl，正向引物1.0μl，反向引物1.0μl，第一轮PCR产物1.0μl，去离子水17.3μl；

（3）PCR反应程序：

两轮PCR反应均采用降落PCR的方法，即95℃预变性5分钟；解链：94℃30秒，退火：61℃30秒，之后退火温度每个循环降低1℃，72℃45秒，13个循环；解链：94℃30秒，退火：49℃30秒，72℃45秒，22个循环；72℃延伸5分钟；4℃保温；

（4）用重亚硫酸盐处理样本基因组DNA 进行PCR扩增后一代测序，然后用序列分析软件对测序峰图CpG位点C/(C+T)峰面积比值进行分析，从而得到该CpG位点的甲基化状态。

9.一种基于一代测序技术直接检测KLF1基因启动子区CpG甲基化的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒在检测样本中KLF1基因启动子区CpG甲基化的应用。