[发明专利]一种检测肠毒素SEA的PSR引物、检测试剂盒和检测方法

说明书

本发明公开了一种检测肠毒素SEA的PSR引物、检测试剂盒和检测方法，所述引物包括检测引物Ft和检测引物Bt，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本发明针对肠毒素SEA设计的PSR检测引物和方法解决了现有技术方法所需周期长，灵敏度低，成本高，现场应用困难等问题。通过选择目标菌株的SEA肠毒素特异性序列的保守区域，设计一对检测引物Ft和Bt构建PSR反应体系，并在60分钟左右获得检测结果，较传统MRSA肠毒素的检测方法大大缩短了检测周期。

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种检测肠毒素SEA的PSR引物、检测试剂盒和检测方法。

背景技术

金黄色葡萄球菌是医院和社区常见的感染菌，近年来随着抗生素的广泛使用，耐药株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Meticillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA)的分离率日趋升高。金黄色葡萄球菌在一定条件下可以分泌一种SEs肠毒素。目前已发现的肠毒素有SEA，SEB，SEC，SED，SEE等类型。此类肠毒素可以造成食物中毒，引起呕吐症状。多项研究表明在MRSA中SEA肠毒素的检测率更高。因此食品中MRSA的SEA肠毒素检测技术成为食源性疾病预防与控制的关键。因此，开发一种高效、灵敏的快速检测MRSA的SEA毒素试剂盒及方法非常重要。

目前微生物的检测鉴定方法主要分为传统培养法、免疫学检测法以及分子生物学技术。传统培养法操作步骤繁琐、检测灵敏度低、实验周期长。免疫学检测法被广泛应用于肠毒素SEA的检测，但是其对实验人员专业水平要求高，成本较高，准确性较低。分子生物学中荧光定量PCR也被用于肠毒素SEA的检测，但同样存在对操作人员水平要求高，成本高的缺点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测肠毒素SEA的PSR引物、检测试剂盒和检测方法，通过对引物的优化提高了灵敏度(达到了630pg/μL)，同时该方法具有操作简便，特异性好，结果准确可靠，检测成本低，适合现场检测应用的特点。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种检测肠毒素SEA的PSR引物，包括检测引物Ft和检测引物Bt，其核苷酸序列分别如下所示：

检测引物Ft：5’-gtctagccataaattgattgg gtggtacaccaaacaa aaca-3’(SEQ IDNO.1)；

检测引物Bt：5’-ggttagttaaataccgatctggcttgaaga tccaa ctcctg-3’(SEQ IDNO.2)；

一种检测肠毒素SEA的试剂盒，包括上述的PSR引物；

所述试剂盒中，各PSR引物的浓度优选50μM；

所述的试剂盒还包括如下组分：

A、2×反应缓冲液：40.0mM的Tris-HCl，20.0mM的硫酸铵，20.0mM的氯化钾，16.0mM的硫酸镁，0.2％(v/v)的Tween 20，1.4M的甜菜碱，10.0mM的dNTPs(each)；

B、Bst DNA聚合酶；

C、钙黄绿素和氯化锰的混合溶液；

所述的Bst DNA聚合酶，其浓度优选8U/μL；

所述钙黄绿素和氯化锰的混合溶液，制备方法如下：

(i)将钙黄绿素溶于二甲基亚砜(DMSO)中，配制50μM的钙黄绿素溶液；将氯化锰溶于水中，配制1mM的氯化锰水溶液；

(ii)取25μL 50μM的钙黄绿素溶液与10μL1 mM的氯化锰水溶液混合均匀，得到钙黄绿素和氯化锰的混合溶液(溶液中钙黄绿素与氯化锰的质量比为1:8)。