[发明专利]3’-O-可逆封闭的核苷酸及其在无模板酶促核酸合成中的应用

说明书

本发明涉及酶法核酸合成领域，具体而言，提供了一种3’‑O‑可逆封闭的核苷酸及其在无模板酶促核酸合成中的应用。本发明提供的3’‑O‑封闭的核苷酸，其封闭基团为氰基乙烯基，氰基乙烯基的作用是实现核苷酸的3’‑OH的可逆封闭，氰基乙烯基体积较小，结构相对稳定，易于合成，成本低，同时可与TdT酶催化位点发生氢键相互作用，稳定结合构象，非常有利于TdT酶催化反应，提高酶促核酸合成的反应速率。

技术领域

本发明涉及酶法核酸合成领域，具体而言，涉及一种3’-O-可逆封闭的核苷酸及其在无模板酶促核酸合成中的应用。

背景技术

目前广泛使用的寡核苷酸合成方法是基于固相亚磷酰胺“脱保护、偶联、盖帽和氧化四步法”的化学合成技术。然而，由于受到合成化学技术的局限，其极限合成长度约为200nt，难以完全满足合成生物学和DNA存储技术等对高通量、高保真、长片段、低成本DNA合成的需求，需要进一步发展新的酶法DNA合成技术。

在DNA酶法合成中，TdT酶(DNA末端转移酶，Terminal deoxynucleotidyltransferase)是一种可在无模板条件下，催化脱氧核糖核酸(dNTP)结合到单链DNA分子3’-OH端的DNA聚合酶。相较于化学法，基于TdT酶的酶法DNA合成潜力巨大：(1)TdT酶催化效率高，其无模板合成DNA单链长度可达8000nt，可使DNA单链合成长度增加数个数量级，打破化学法合成长度的限制；(2)酶法合成过程，反应条件温和，减少了对DNA的损伤，有助于提高DNA合成产物的准确性；(3)反应过程均是在水相中进行，无需使用有毒化合物；(4)合成步骤少，循环速率更快，合成效率更高，可大幅降低合成DNA成本。此外，DNA酶法合成技术完全兼容天然DNA(3’-OH未保护的DNA)，从而实现对天然DNA进行人工修改。DNA酶法合成技术的发展将大幅提升合成生物学在设计和组装基因网络的能力，同时也为DNA数据存储、DNA纳米材料的设计和制造等领域带来重要变革。

然而天然的TdT酶只能在DNA链3’-末端随机添加dNTP，无法精确控制酶促延伸过程，不能满足人工DNA合成需求。因此，酶法DNA合成技术的关键点就是通过构建适当的反应体系，以实现控制TdT酶精确合成DNA链。

基于TdT酶的催化特定，一类重要的控制策略是利用可逆终止基团阻断dNTP 3’-OH成键位点，实现对酶促DNA延伸的控制。具体来说，当DNA延伸所需的3’-OH基团被可逆终止基团阻断时，TdT酶催化DNA链延伸将终止，从而达到精确控制酶促DNA合成的目的；随后，将可逆终止基团脱保护除去，将DNA链3’-OH释放出来，继续下一轮的酶促延伸反应，如此循环进行“停止-重启”，实现TdT酶催化无模板合成目标DNA链。

由于在核苷酸3’-OH上引入保护基将影响底物与酶的结合，降低TdT酶催化延伸速率，因此，选取合适的可逆终止基团用于控制TdT酶促延伸是无模板DNA合成的关键。甲基、2-硝基苄基、烯丙基、叠氮甲基、氨基及叔丁氧基乙氧基等均可作为可逆终止保护基团，但这些保护基存在催化延伸速率低、精确度不足、脱保护效率低、相应dNTP合成过程复杂、成本高等问题，目前，仍不能满足工业化合成DNA的要求，未见大规模应用于基因组的合成。因此，酶法DNA合成技术尚待进一步开发优化，迫切需要研发基于新的可逆终止基团的无模板TdT酶法DNA合成技术。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种3’-O-封闭的核苷酸。

本发明的第二目的在于提供上述3’-O-封闭的核苷酸在酶促核酸合成中的应用。

本发明的第三目的在于提供上述3’-O-封闭的核苷酸的制备方法。

本发明的第四目的在于提供上述3’-O-封闭的核苷酸的脱保护方法。

本发明的第五目的在于提供一种酶促核酸合成的方法。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：