[发明专利]一种蔗糖合成酶及其在催化糖基化反应中的应用

说明书

本发明公开了一种蔗糖合成酶用于酶法制备糖基化天然产物的方法。该方法利用低等真核来源的蔗糖合成酶和UDP‑糖基转移酶，以底物和蔗糖为原料生产糖基化产物。本发明的方法首先利用基因挖掘技术筛选得到具有UDP底物亲和力的蔗糖合成酶，并将其用于与UDP‑葡萄糖基转移酶在同一载体上共表达，然后收集生物酶粗品直接进行底物催化反应，通过新型蔗糖合成酶催化蔗糖实现UDP‑葡萄糖的高效循环，使UDP‑葡萄糖基转移酶具有持续的UDP‑葡萄糖补给催化底物糖基化。该方法与已有的双酶催化反应系统相比，转化速率快，收率高，具有重要且广泛的应用价值。

技术领域

本发明利用微芒藻蔗糖合成酶和UDP-糖基转移酶，实现酶法高效催化糖基化反应，属于生物催化转化技术领域。

背景技术

蔗糖合成酶(Sucrose synthase，EC 2.4.1.13,SuSy)是一种糖基转移酶(GT),在小麦(Triticum aestivum)胚芽中首次被鉴定，最近在细菌中也被发现。近几十年的研究发现,这种酶广泛存在于植物体内，对植物的生长发育极为重要，是叶片光合作用的产物蔗糖进入下游各种代谢途径的必需关键酶之一。该酶催化单糖和二磷酸核苷(NDP)之间的葡糖基部分的可逆转移。

蔗糖合成酶对于不同的核苷二磷酸(NDP)“受体”具有广泛的底物谱。通过将SuSy与UDP-糖基转移酶结合来回收“供体”尿苷5'-二磷酸(UDP)在生物催化糖基化过程中更为重要，因为GT已知大多数缀合物的糖基化都需要UDP-葡萄糖(UDPG)的参与。在GT-SuSy级联反应中，使用蔗糖和糖基转移酶构建UDP循环。实现了从经济廉价的蔗糖和UDP向昂贵的UDP-葡萄糖转化的生产过程。植物蔗糖合成酶主要以UDP作为核苷酸受体，最适温度在40至55℃之间，在高于30℃的温度下酶的稳定性会下降【1/2】。细菌蔗糖合成酶虽然在高温(60-80℃)下能够显示出最大活性在表现出最佳温度，但其主要以ADP作为主要核苷酸受体【3】。

因此，在确定底物选择性和糖基化位置的情况下，UDP-糖基转移酶偶联原位再生UDP-葡萄糖的蔗糖合成酶以生产目标糖苷的方法主要在两种酶的活性和稳定性方面存在缺陷。大多数植物来源的蔗糖合成酶的热稳定性不能支持足够的时间来转化底物；而细菌来源的蔗糖合成酶虽有相对较高的热稳定性，但其天然底物选择性更偏向于其他几种NDP，且多数活性较低。

[1]Elling LKula M-R.Characterization of sucrose synthase from ricegrains for the enzymatic synthesis of UDP and TDP glucose[J].Enzyme andMicrobial Technology,1995,17(10):929-934.

[2]U,Schrader H,Günther N,et al.Expression,purification andcharacterization of recombinant sucrose synthase 1from Solanum tuberosumL.for carbohydrate engineering[J].Journal of Biotechnology,2004,107(2):135-149.

[3]Diricks M,De Bruyn F,Van Daele P,et al.Identification of sucrosesynthase in nonphotosynthetic bacteria and characterization of therecombinant enzymes[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2015,99(20):8465-8474.

[4]Miller G L.Use of dinitrosalicylic acid reagent for determinationof reducing sugar.[J].Journal of Analytical Chemistry,1959,31:426-428.