[发明专利]一种牛传染性鼻气管炎病毒的检测方法

说明书

本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种牛传染性鼻气管炎病毒的检测方法，其中包括特异性目标序列，如SEQ ID NO.1所示，试剂盒包括荧光定量PCR检测引物对和探针，引物对如SEQ ID NO.2所示和SEQ ID NO.3所示；探针的序列如SEQ ID NO.4所示的。本发明设计的用于检测牛传染性鼻气管炎病毒的TaqMan探针荧光定量PCR试剂盒具有很高的特异性和灵敏性，能够用于筛选各临床样品检测牛传染性鼻气管炎阳性样本，具有检测时间短，检测灵敏度高，稳定性高的特点。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种牛传染性鼻气管炎病毒的检测方法。

背景技术

牛传染性鼻气管炎(Infectious Bovine Rhinotracheitis，IBR)又叫“坏死性鼻炎”、“红鼻病”，该病是由牛疱疹病毒Ⅰ型(Bovine herpes virus type 1，BHV-1)引起的一种急性、热性接触性传染病，会引起牛严重的呼吸道感染，并有时会出现结膜炎、脑炎、产奶量减少、子宫炎、肠炎、传染性脓疱性外阴阴道炎等症状。病毒可以在宿主的整个生命周期中保持潜伏状态，这种病毒是自我重新激活型的，可通过压力和皮质类固醇治疗重新激活，导致复发，造成环境中病毒和传播的永久化，严重影响动物健康和生产力，因流产、死亡、屠宰需求和产奶量下降而给养牛业带来重大经济损失。传统的病毒分离技术用时较长，且有一定的技术要求，传统PCR检测存在一定误差准确性不高，血清学抗体检测阴性的牛也有可能是病毒携者，因此，建立一种灵敏、稳定、快速的IBRV检测方法对于准确筛查患畜、有效控制IBR的传播至关重要。

发明内容

本发明目的在于，提供一种利用IBRV截断gB基因建立的牛传染性鼻气管炎病毒的TaqMan探针荧光定量PCR检测方法，能够高效、准确的检测牛传染性鼻气管炎阳性样本的检测方法。

本发明的技术方案：一、一种用于检测牛传染性鼻气管炎病毒的特异性目标片段，如SEQ ID NO.1所示，具体通过对NCBI数据库中所有IBRV gB基因组DNA对比分析，选定同源性、抗原性、亲水性和表面展示概率相对最强的部分，特异性目标片段的基因大小为79bp。

二、用于扩增上述特异性目标片段的特异性引物对及探针，所述特异性引物对的上游引物为5'CTACTACAAGCGCGA CATGG 3'，如SEQ ID NO.2所示，

下游引物为5'CACGTGCTGTGTACGC AAA 3'，如SEQ ID NO.3所示；

所述探针为5'HEX-ACCGGCTCCTTGAGGCGCCG-BHQ-1 3'，如SEQ ID NO.4所示，其中，5’端标记有荧光基团HEX，3’端标记有淬灭基团BHQ-1。

三、一种用于检测牛传染性鼻气管炎病毒的TaqMan探针荧光定量PCR试剂盒，包含有上述的特异性引物对和探针。

四、使用上述的试剂盒的检测步骤如下：

步骤1、提取待检测样品的总DNA；

步骤2、以上述DNA为模板，利用TaqMan探针荧光定量PCR试剂盒进行荧光定量PCR扩增得到扩增曲线，其优化后的反应体系如下，总体系为20μL；

步骤3、对所述扩增曲线进行分析，并作出判断。其中，所述步骤2中扩增的反应体系具体包括：权利要求2所述的特异性引物对和探针；2×PerfectStart^TMⅡProbe qPCRSuperMix；RNase-free waster；牛传染性鼻气管炎病毒标准阳性质粒；扩增程序为：94℃预变性30s；94℃变性5s；60℃退火和延伸30s，共40个循环。