本发明提出一种同时检测牛诺如病毒和牛轮状病毒的引物探针组合、试剂盒及其应用，属于生物技术领域，能够解决现有技术中尚无同时用于检测牛诺如病毒和牛轮状病毒的双重RAA‑LFD方法的技术问题。该引物探针组合中的引物分别为BNoV‑F、BNoV‑R和BRV‑F、BRV‑R，BNoV‑F、BNoV‑R和BRV‑F、BRV‑R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.27‑28和SEQ ID NO.53‑54所示，所述引物探针组合中的探针为BNoV‑P和BRV‑P，所述BNoV‑P和BRV‑P的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.59‑60所示。本发明能够从导致犊牛腹泻的病毒中快速、准确地检测出牛诺如病毒和牛轮状病毒，在39℃较低反应温度下反应时间仅需30min，试纸条结果仅需5min即可完成检测。本发明能够应用于基层现场牛诺如病毒和牛轮状病毒的可视化检测方面。
本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种牛传染性鼻气管炎病毒的检测方法，其中包括特异性目标序列，如SEQ ID NO.1所示，试剂盒包括荧光定量PCR检测引物对和探针，引物对如SEQ ID NO.2所示和SEQ ID NO.3所示；探针的序列如SEQ ID NO.4所示的。本发明设计的用于检测牛传染性鼻气管炎病毒的TaqMan探针荧光定量PCR试剂盒具有很高的特异性和灵敏性，能够用于筛选各临床样品检测牛传染性鼻气管炎阳性样本，具有检测时间短，检测灵敏度高，稳定性高的特点。
本发明是基于微滴式数字PCR技术检测牛冠状病毒的检测方法，包括目标片段如SEQ ID NO.1，所特异性引物对和探针。本发明牛冠状病毒微滴式数字PCR检测试剂盒的灵敏度为1copies/μL，并只能特异性检测牛传冠状病毒。使用本发明的试剂盒检测临床采集的牛腹泻样品，结果表明其阳性率高于现有的qPCR，可以实现痕量病毒的检测，且无需标准曲线即可对核酸进行绝对定量。本发明的检测方法可实现对牛冠状病毒的高特异性、高灵敏度、绝对定量检测，具有高通量检测、精确度更高、更数字化、节约时间等优点。
